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背景和目的:心力衰竭（心衰）是各种心脏病的最终结局,心肌梗死是心衰最常见的病因。心肌梗死后,神经-内分泌系统激活,神经内分泌因子例如血管紧张素Ⅱ（angiotensin Ⅱ,Ang Ⅱ）、肾上腺素、内皮素等释放增加,启动进行性心室重构。在心室重构初期,心肌细胞代偿性肥大,随即出现心肌细胞凋亡。心肌细胞凋亡是心脏收缩蛋白减少和心脏舒缩功能减低的重要原因。低水平但持续进展的心肌细胞凋亡可导致致命性心衰。同时,在衰竭心肌中常常发现细胞自噬水平上调。自噬是另一种细胞死亡方式,但目前认为,自噬最初是一种细胞保护机制,可以在心衰时通过分解和回收细胞内的有用成分、补充细胞必需的代谢底物来减少心肌细胞凋亡、保护心脏功能。因此,抑制心肌细胞凋亡、促进心肌细胞自噬可能是治疗心梗后心衰的有效策略。课题组前期研究结果显示,心梗后心衰大鼠心肌与对照组大鼠心肌相比,多个与雷帕霉素靶蛋白（mechanistic target of rapamycin,mTOR）通路相关的基因差异性表达。mTOR是一种细胞内非典型丝/苏氨酸激酶,通过与多种不同的蛋白组成mTOR复合体1（mTORC1）和mTOR复合体2（mTORC2）参与调控细胞的生长、存活和自噬。mTORC1和mTORC2的功能截然不同而又相互关联。mTORC1主要通过促进合成代谢,例如蛋白合成等生理过程促进细胞生长,同时,mTORC1是机体抑制分解代谢,例如细胞自噬的关键性蛋白复合体。而mTORC2的功能目前尚未完全阐明,研究表明mTORC2可能在细胞极性和细胞存活调控中发挥重要作用。雷帕霉素是mTOR的抑制剂,也是临床中常用的抗肿瘤药物和冠脉支架涂层药物。雷帕霉素对mTORC1具有快速、直接的抑制作用,长期应用雷帕霉素,因其“占用”mTOR、影响mTORC2的装配,也可抑制mTORC2的功能。在压力负荷诱导的心肌肥大模型和急性心肌缺血动物模型中发现,雷帕霉素可以通过抑制mTORC1减轻心肌肥大、激活心肌细胞自噬、减少心肌梗死面积等发挥其心脏保护作用。但心梗后心衰常常由陈旧性心肌梗死发展而来,多表现为慢性病程,与压力负荷诱导的心肌肥大和急性心肌缺血的发病机制不完全相同。在心梗后心衰中,雷帕霉素能否通过抑制mTORC1通路、激活心肌细胞自噬发挥其抗心肌细胞凋亡和改善心功能的作用;当长期应用雷帕霉素抑制mTORC2通路后其抗心肌细胞凋亡作用是否受到影响;以及雷帕霉素抗心肌细胞凋亡的作用机制尚未有报道。综上,本研究通过构建心梗后心衰大鼠和体外Ang Ⅱ诱导的H9c2细胞凋亡模型,研究雷帕霉素对心肌细胞凋亡、自噬和心功能的影响,探讨雷帕霉素对心肌细胞凋亡的调控机制。方法:通过结扎Wistar大鼠冠脉前降支构建心肌梗死模型,在心肌梗死后4周,利用超声心动图评估心功能,随后给予雷帕霉素（1.4 mg/kg/天）或DMSO（溶媒）腹腔注射,持续4周,在心肌梗死后8周和12周评估心功能后处死。取心脏观察其大体形态,分离左心室行HE、Masson和caspase-3免疫组化染色,分离远离梗死区心肌组织用于凋亡、自噬、mTORC1通路、mTORC2通路和内质网应激通路相关蛋白水平的Western blot检测。应用Ang Ⅱ构建体外H9c2大鼠源心肌细胞凋亡模型,通过检测不同Ang Ⅱ作用浓度和不同Ang Ⅱ作用时间下细胞活力确定Ang Ⅱ诱导H9c2细胞凋亡的条件。在给予H9c2细胞短时间和长时间雷帕霉素预处理后,通过流式细胞术、caspase-3酶活性检测、免疫荧光术和凋亡、自噬相关蛋白表达水平的Western blot检测,评估雷帕霉素对H9c2细胞凋亡和自噬的影响,通过mTORC1、mTORC2和内质网应激通路相关蛋白表达水平的Western blot检测,探讨雷帕霉素对H9c2细胞凋亡和自噬的调控机制。结果:1.心梗后心衰大鼠心肌转录组表达谱心梗后心衰组（心梗后8周）相比假手术组大鼠心肌转录组表达谱差异显著,其中,10个基因表达水平上调,26个基因表达水平下调,差异表达基因的功能主要与凋亡,蛋白质合成,基因转录、翻译,炎症,自噬,氨基酸、脂类代谢等相关,多个差异表达基因与mTOR通路密切相关。2.雷帕霉素可延缓心梗后心衰大鼠心室重构,改善其心功能心梗术后8周,相比DMSO组,雷帕霉素组大鼠的左室射血分数（57±2（4）vs.47±3（4）,P（27）0.05）和左室缩短率（28±1（4）vs.20±1（4）,P（27）0.05）显著增加,左室舒张末内径（600±45 mm vs.833±33 mm,P（27）0.05）和左室收缩末内径（400±45 mm vs.650±34 mm,P（27）0.05）显著降低,心肌细胞肥大减轻。心梗术后12周,雷帕霉素对心梗后心衰大鼠左室射血分数（55±2（4）vs.40±3（4）,P（27）0.05）和左室缩短率（25±1（4）vs.17±1（4）,P（27）0.05）仍具有改善作用。3.雷帕霉素可抑制心肌细胞caspase-3剪切,促进心肌细胞自噬心梗术后8周,相比DMSO组,雷帕霉素组大鼠心肌中细胞凋亡指标cleaved caspase-3水平显著下调,细胞自噬标记物LC3B Ⅱ水平显著上调、自噬底物p62水平显著下调。在心梗术后12周,亦可观察到相似的结果。4.雷帕霉素可抑制心肌mTOR通路关键分子的表达心梗术后8周,DMSO组大鼠心肌中mTORC1下游RibS6Ser235/236水平被显著上调,提示心梗后mTORC1活性上调、心肌内蛋白合成增加。相比DMSO组,雷帕霉素可显著抑制RibS6Ser235/236和mTORC2下游AktSer473的表达。心梗术后12周（停用雷帕霉素4周）,相比DMSO组,雷帕霉素组RibS6Ser235/236表达仍受到轻微抑制,AktSer473表达水平恢复至基线。5.在体外细胞实验中,雷帕霉素可抑制H9c2细胞凋亡、激活H9c2细胞自噬Ang Ⅱ（100 nM,24小时）可在体外诱导与体内衰竭心肌中心肌细胞凋亡模式相似的H9c2细胞凋亡模型。流式细胞术,细胞caspase-3酶活性及Western blot检测cleaved caspase-3表达水平的结果显示,短时间（30分钟）和长时间（24小时）雷帕霉素预处理均可显著降低Ang Ⅱ诱导的H9c2细胞凋亡率。Western blot和细胞免疫荧光术检测自噬标记性蛋白表达的结果显示,短时间和长时间雷帕霉素预处理均可显著上调基础的和Ang Ⅱ诱导的H9c2细胞自噬水平。6.在体外细胞实验中,雷帕霉素显著抑制mTORC1通路关键分子的表达Ang Ⅱ诱导的H9c2细胞内RibS6Ser235/236表达水平上调,短时间和长时间雷帕霉素预处理可显著抑制RibS6Ser235/236的表达,但对AktSer473的表达无明显影响。7.雷帕霉素通过抑制mTORC1-内质网应激通路减少心梗后心衰大鼠和Ang Ⅱ诱导的H9c2细胞凋亡在心梗后心衰大鼠和Ang Ⅱ诱导后的H9c2细胞中,雷帕霉素可显著下调内质网应激通路中诱导细胞凋亡的关键性分子--磷酸化JNK和DDIT3的表达水平。结论:在心梗后心衰中,雷帕霉素可能主要通过抑制心肌细胞内mTORC1通路,减少新生蛋白合成并增加自噬性蛋白降解,进而抑制下游内质网应激通路,减少心肌细胞凋亡,延缓心室重构,改善心功能。