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第一部分:TFPI-2对原代心房肌细胞和成纤维细胞纤维化相关表型和机制作用初探目的:初步探究TFPI-2对原代心房肌细胞和成纤维细胞纤维化相关表型和机制作用。方法:对SD乳鼠心房组织通过酶解法分离、培养并采用免疫荧光鉴定获得原代心房肌细胞和心房成纤维细胞;CCK-8检测TFPI-2对两种细胞活力影响;流式细胞术检测TFPI-2对两种细胞凋亡影响;transwell实验检测TFPI-2对心房成纤维细胞迁移影响;western blot实验检测调节细胞活力和迁移相关蛋白p-Erk1/2的水平、细胞凋亡相关蛋白PARP和促纤维化蛋白(Col-Ⅰ、Col-Ⅲ、MMP-9 和 MMP-2)表达变化。结果:成功分离培养、鉴定获得纯度较高可用于实验的SD乳鼠心房肌细胞和心房成纤维细胞;TFPI-2可以呈浓度梯度依赖性降低两种细胞的细胞活力,且TFPI-2可以抑制心房成纤维细胞迁移并诱导心房成纤维细胞凋亡;TFPI-2在两种细胞中可以下调促纤维化蛋白(Col-Ⅰ、Col-Ⅲ、MMP-9和MMP-2)的表达;TFPI-2诱导心房成纤维细胞凋亡蛋白PARP表达上调。结论:TFPI-2可以发挥抗纤维化作用,其抗纤维化作用的实现可以通过降低p-Erk1/2的水平从而降低心房成纤维细胞活力和迁移、上调PARP表达从而诱导心房成纤维细胞凋亡、下调细胞促纤维化蛋白(Col-Ⅰ、Col-Ⅲ、MMP-9和MMP-2)的表达。第二部分:TFPI-2对小鼠HL-1心房肌细胞和小鼠NIH/3T3成纤维细胞纤维化相关表型的作用目的:研究TFPI-2对小鼠HL-1细胞和NIH/3T3细胞纤维化相关表型的作用。方法:通过慢病毒介导的方法构建TFPI-2上调HL-1小鼠心房肌细胞稳转株并用q-RT-PCR验证;通过MTT法测定TFPI-2和TGF-β1对HL-1心房肌细胞系和NIH/3T3成纤维细胞系细胞增殖的影响;通过流式细胞术测定TFPI-2对HL-1心房肌细胞和NIH/3T3成纤维细胞凋亡影响;通过transwell小室共培养TFPI-2上调的HL-1细胞稳转株和NIH/3T3成纤维细胞,以期测定TFPI-2上调的HL-1细胞稳转株细胞培养基上清对NIH/3T3成纤维细胞迁移影响;通过划痕实验测定TFPI-2对NIH/3T3成纤维细胞迁移影响。结果:通过荧光显微镜观察绿色荧光蛋白GFP表达和q-RT-PCR验证HL-1-TFPI-2细胞稳转株构建成功;MTT实验表明TFPI-2抑制HL-1心房肌细胞和NIH/3T3成纤维细胞增殖;transwell共培养实验和划痕实验表明TFPI-2抑制了 NIH/3T3成纤维细胞迁移;流式细胞术双染法表明TFPI-2诱导NIH/3T3成纤维细胞凋亡。结论:成功构建HL-1-TFPI-2细胞稳转株;TGF-β1促进HL-1细胞和NIH/3T3细胞增殖,而TFPI-2抑制两种细胞增殖;TFPI-2抑制NIH/3T3细胞迁移并诱导其凋亡。第三部分:TFPI-2抗心房纤维化机制目的:研究TFPI-2对HL-1细胞和NIH/3T3细胞抗纤维化机制。方法:通过收集TFPI-2上调的HL-1小鼠心房肌细胞稳转株培养基上清采用明胶酶谱实验检测TFPI-2对MMP-9和MMP-2活性影响;通过实时荧光定量PCR实验检测TFPI-2对HL-1心房肌细胞和NIH/3T3成纤维细胞促纤维化分子(Col-Ⅰ,Col-Ⅲ,MMP-9,MMP-2,TGF-β1)mRNA 转录水平影响;siRNA干扰技术下调两种细胞TFPI-2,检测促纤维化蛋白(Col-Ⅰ,Col-Ⅲ,MMP-9,MMP-2)表达;通过双荧光素酶报告基因实验检测在HL-1心房肌细胞和NIH/3T3成纤维细胞中TFPI-2对MMP-2和MMP-9基因启动子活性影响;通过western blot实验检测:在TFPI-2上调HL-1细胞稳转株中促纤维化蛋白(Col-Ⅰ,Col-Ⅲ,MMP-9和MMP-2)表达影响,在NIH/3T3成纤维细胞中TFPI-2对MAPK信号通路、NF-κB/MMP信号通路、TGF-β1/Smad/Collagen信号通路、Bcl-2/B ax蛋白表达调控影响,在HL-1细胞和NIH/3T3中检测 TGF-β1 对 TFPI-2 及促纤维化蛋白(Col-Ⅰ,Col-Ⅲ,MMP-9 和 MMP-2)表达影响。结果:TFPI-2直接抑制了 MMP-9和MMP-2活性;TFPI-2下调了 HL-1心房肌细胞和NIH/3T3成纤维细胞促纤维化分子(Col-Ⅲ,Col-Ⅰ,MMP-9,MMP-2,TGF-β1)mRNA转录水平;TFPI-2抑制了 HL-1心房肌细胞和NIH/3T3成纤维细胞MMP-2和MMP-9基因启动子转录活性;western blot实验表明:在HL-1-TFPI-2上调细胞稳转株中TFPI-2下调促纤维化蛋白(Col-Ⅲ、Col-I、MMP-2、MMP-9)表达,在两种细胞中敲低 TFPI-2 后,促纤维化蛋白(Col-Ⅲ、Col-Ⅰ、MMP-2、MMP-9)表达上调,在 NIH/3T3成纤维细胞中TFPI-2下调p-Erk1/2水平并上调p-JNK、p-P38水平调控MAPK 信号通路,TFPI-2 下调 NF-κB、p-NF-αB、MMP-2 和 MMP-9 水平调控 NF-κB/MMP 信号通路,TFPI-2 下调 TGF-β1、Col-Ⅰ、Col-Ⅲ、p-Smad2、p-Smad3水平调控TGF-β1信号通路,TFPI-2下调Bcl-2表达、上调Bax蛋白表达,TGF-β1促进HL-1细胞促纤维化蛋白(Col-Ⅰ,Col-Ⅲ,MMP-9)表达,TGF-β1促进NIH/3T3成纤维细胞促纤维化蛋白(Col-Ⅲ,Col-Ⅰ,MMP-9,MMP-2,α-SMA)表达。结论:TGF-β1刺激HL-1细胞和NIH/3T3细胞促纤维化蛋白(Col-Ⅲ、Col-Ⅰ、MMP-2、MMP-9)表达;在HL-1心房肌细胞,TFPI-2通过抑制促纤维化分子(Col-Ⅲ、Col-Ⅰ、MMP-2、MMP-9、TGF-β1)转录和表达发挥其抗纤维化作用;在NIH/3T3成纤维细胞,TFPI-2通过以下方式实现其抗纤维化作用:在MAPK信号通路中TFPI-2通过下调β-Erk1/2水平抑制成纤维细胞增殖和迁移且通过上调β-JNK、β-P38水平诱导成纤维细胞凋亡,在NF-κB/MMPs 信号通路 TFPI-2 不仅通过下调 NF-κB、p-NF-κB、MMP-2 和MMP-9水平抑制纤维化而且TFPI-2通过直接抑制了 MMP-2和MMP-9活性发挥这一作用,在TGF-β信号通路TFPI-2通过下调TGF-β1、Col-Ⅰ,Col-Ⅲ、β-Smad2、β-Smad3水平来发挥抗纤维化作用,TFPI-2诱导NIH/3T3成纤维细胞凋亡通过上调蛋白Bax并下调Bcl-2表达抗纤维化。