EZH2(enhancer of zeste homolog 2)是多梳抑制复合物2(polycomb repressive complex 2,PRC2)的核心成员,具有组蛋白甲基转移酶活性,可以催化组蛋白3第27位赖氨基酸上的三甲基化(H3K27me3)。这一组蛋白修饰介导的基因表观遗传沉默,是许多肿瘤抑制基因失活的方式之一;与此相应,EZH2在多种癌症的发生发展中是过度表达的,因此被看作为一个癌症治疗的靶点。DZNep是第一个通过药物筛选而被报道的EZH2小分子抑制剂,目前已有很多研究将这一药物应用于EZH2异常增高的肿瘤细胞或癌症病人,并已取得一定的抗肿瘤效果。然而DZNep本质上是S-腺苷高半胱氨酸水解酶(S-adenosyl homocysteine hydrolase,SAHH)的抑制剂,理论上并不是一种特异性EZH2的抑制剂。因此,关于DZNep的抗肿瘤机制是否仅仅是通过抑制EZH2活性、逆转特定抑癌基因的组蛋白甲基化而使其恢复表达,对此目前的研究报道还存在相互矛盾的结果或解释。由于DZNep最直接的生化作用是抑制SAHH,导致细胞内甲基转移反应的共同产物S-腺苷高半胱氨酸(S-adenosyl homocysteine,SAH)积累,从而间接地抑制包括EZH2在内的多种甲基转移酶活性;这些作用的效果可能涉及细胞内一碳单位的循环、甲基供体的可获得性以及与代谢有关的应激反应等多种生物学效应。因此,我们推测DZNep的抗肿瘤效果可能也不是单一的。进一步阐明DZNep的抗肿瘤机制,可以为这类药物的临床应用提供理论基础。【目的】探讨DZNep可能非依赖于EZH2的抗肿瘤生物功能及是否可以通过改变细胞的染色质结构,进而增强对DNA损伤反应的敏感性,诱导细胞衰老,进而发挥肿瘤抑制作用。【方法】以HepG2细胞株为模型,首先比较两种分别间接和直接抑制EZH2的小分子药物作用效果的差异,根据细胞在增殖、死亡、形态等方面的表现,推测DZNep抑制肿瘤细胞增殖主要是通过促进细胞的衰老,并通过β-半乳糖苷酶染色实验加以证实;根据细胞周期阻滞的时期、细胞周期抑制蛋白的表达,确定DZNep促进细胞衰老的信号途径;通过细胞免疫荧光分析p53的表达量与核内转移确定其激活状态;最后通过分析DNA损伤反应(DNA Damage Response,DDR)通路的上游信号与炎症相关因子的表达,确定dznep促进的细胞衰老是通过ddr信号途径引发、并通过炎症因子得以维持和增强。【结果】1.ezh2的直接抑制剂gsk343对hepg2的作用主要引起剂量依赖型的细胞死亡,而dznep的效应则是抑制细胞生长,同时高效液相定性分析可见sah在细胞内积累;2.dznep处理引起细胞形态变为扁平、胞内颗粒物增加等衰老样改变,且sa-b-gal染色呈阳性绿色;3.dznep使g2/m期细胞比例从11.01%提高到28.72%,提示细胞周期阻滞于g2/m期;与此相应,细胞周期抑制相关因子p21表达升高4.dznep可促进p53蛋白在细胞内稳定性增加并向核内转移,与上一结果相结合,表明dznep导致的细胞衰老是通过p53-p21途径;5.在ddr的上游信号中,γh2ax、atm、pchk1和pchk2表达增强,其中atm、pchk1在24小时内表达明显增强;而ezh2则在72小时后表达逐渐减弱,表明dznep诱发的ddr是其药物作用的早期效应;6.伴随dznep导致的细胞衰老,炎性因子cxcr2、igfbp7和il8基因的转录水平明显提高,表明dznep通过ddr途径促进细胞衰老,而衰老的细胞又通过衰老相关分泌表型(senescence-associatedsecretoryphenotype,sasp)进一步强化了细胞的衰老效应。7.通过表达谱芯片分析表明,在10个与dznep效应最相关的信号通路中,前两个均为组蛋白异构体相关基因,提示dznep的效应可能与染色质状态的扰动与重构有关;同时芯片分析还初步鉴定了三个可能通过参与dna修复而降低抗癌药物作用效果的基因(aldh3a,trim29,和tp53i3)。【结论】本研究通过探讨dznep非依赖于ezh2的生物学功能,发现它可通过激活atm信号途径来诱发dna损伤反应,并通过p53-p21通路引起细胞衰老。我们的这一发现具有以下两点意义:首先,我们的研究表明,与促进肿瘤细胞凋亡一样,促进肿瘤细胞的衰老同样是一条值得探索和开发的抗肿瘤途径;其次,可以利用dznep能够诱发dna损伤反应这一特性,与放疗、化疗手段相结合,提高这些传统的癌症治疗手段的效果。最后,本研究表明DZNep可以激活ATM,然而这种激活作用究竟是通过何种具体方式(DNA断裂、ROS增加、染色质状态改变等),还有待于进一步深入研究。