【摘 要】
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背景:结肠癌起源于肠上皮的局部腺癌,是人类常见的恶性肿瘤之一,发病率达到10.2%,位于人类十大恶性肿瘤的第三位,其严重危害着人类的生命及健康。然而,其确切发病机制仍不清楚,而且结肠癌的起病隐匿,预后较差及死亡率高,这对于结肠癌的诊断和治疗来说是一个巨大的挑战。因此,寻找结肠癌有效诊断的新的标志物和治疗靶点成为临床研究的一个热点。ARHGEF16是一种鸟嘌呤核苷交换因子,参与调节小G蛋白的激活,而
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背景:结肠癌起源于肠上皮的局部腺癌,是人类常见的恶性肿瘤之一,发病率达到10.2%,位于人类十大恶性肿瘤的第三位,其严重危害着人类的生命及健康。然而,其确切发病机制仍不清楚,而且结肠癌的起病隐匿,预后较差及死亡率高,这对于结肠癌的诊断和治疗来说是一个巨大的挑战。因此,寻找结肠癌有效诊断的新的标志物和治疗靶点成为临床研究的一个热点。ARHGEF16是一种鸟嘌呤核苷交换因子,参与调节小G蛋白的激活,而小G蛋白在细胞信号转导通路中发挥着分子开关的作用,还参与细胞骨架的调控。ARHGEF16在多种肿瘤的信号通路中扮演着至关重要的作用,已经成为一个重要的致癌基因。但是,在结肠癌中ARHGEF16是否同样发挥促进肿瘤发生发展的作用还有待进一步研究。通过酵母双杂交系统,我们发现FYN可能可以与ARHGEF16发生相互作用。FYN是一个非受体酪氨酸激酶,它在细胞生长和存活的调节,细胞粘附,细胞骨架重塑,细胞运动等生物过程都起作用,在很多肿瘤中都异常表达和活化,并且在肿瘤的发生发展中起到很重要的作用。不过,FYN在结肠癌中起到的作用还未见有相关报导,并且ARHGEF16和FYN是否确实可以发生直接的蛋白相互作用,它们又是以哪种分子机制来调控的也有待研究。因此,研究ARHGEF16/FYN在结肠癌中的作用及分子机制,对结肠癌的临床诊断和靶向治疗药物研发具有重要意义。研究目的:1、验证ARHGEF16在结肠癌细胞和组织中高表达。2、研究ARHGEF16对结肠癌细胞的增殖和肿瘤形成的影响。3、验证ARHGEF16与FYN的直接相互作用。4、研究FYN对结肠癌细胞的生长增殖的影响。5、研究ARHGEF16与FYN的分子作用机制。研究方法:1、运用western blot和免疫组织化学检测ARHGEF16在结肠癌细胞和临床组织样本中的表达情况。2、在功能学方面,采用细胞克隆形成、Ed U、Transwell实验来研究ARHGEF16对结肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭的影响。利用裸鼠皮下移植瘤实验探讨ARHGEF16在肿瘤形成中的作用。3、利用蛋白质免疫共沉淀、GST-pulldown验证ARHGEF16与FYN的相互作用,并对ARHGEF16进行分段,寻找其与FYN发生相互作用的片段。4、在过表达ARHGEF16结肠癌细胞中敲低FYN的表达或用Src酪氨酸激酶抑制剂处理,检测其对结肠癌细胞增殖和迁移的影响。5、向293T细胞中外转ARHGEF16和FYN的标签质粒,检测FYN对ARHGEF16磷酸化的影响。6、在结肠癌细胞中干扰FYN,使用蛋白合成抑制剂CHX和蛋白酶体抑制剂MG132处理,检测FYN对ARHGEF16蛋白稳定的影响。研究结果:1、临床组织标本检测结果显示:与对照相比ARHGEF16在结肠癌组织中相对高表达。同时,它在几种结肠癌细胞中也高表达。2、ARHGEF16的高表达可以促进结肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭,并且可以促进肿瘤的形成。3、FYN可以与ARHGEF16发生直接相互作用,并增强ARHGEF16的磷酸化水平。4、敲低FYN的表达和用Src酪氨酸激酶抑制剂处理后,ARHGEF16促进结肠癌细胞生长增殖的能力会下降。5、FYN可以抑制ARHGEF16通过蛋白酶体的降解,稳定ARHGEF16的蛋白表达。结论:1、ARHGEF16在结肠癌组织和细胞中高表达。2、ARHGEF16介导结肠癌细胞的增殖和迁移,并且依赖于FYN的表达。3、FYN通过与ARHGEF16发生相互作用,增加了ARHGEF16的磷酸化水平和蛋白稳定性。
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