研究背影:肺炎支原体是引起世界范围内儿童和青年人社区获得性肺炎(CAP)最常见的病原体之一,其在各个年龄组都可引起上呼吸道和下呼吸道感染,可占5岁以上儿童CAP的50%以上。支原体肺炎在全年都可爆发,并且与地理区域,气候和季节无显著相关,可在大范围的社区中流行,且经常不被发现,或者很晚才被发现。在大型或小型社区进行长期流行病学研究和地理监测后,据报道肺炎支原体每4-7年就会出现一次循环性流行。肺炎支原体感染是散发性的,持续时间长,流行间隔时间不定。肺炎支原体流行时间延长主要是由于其潜伏期长(长达3周),以及微生物在呼吸道中持续时间延长所致。患者即使在无症状的情况下仍可携带肺炎支原体,并且长时间排出肺炎支原体。因此,在长时间内,仍有这种无症状的携带者传播疾病的可能性。肺炎支原体是一类能在无生命培养基中自我复制的最小、最简单的原核细胞,没有细胞壁。该生物呈多行性,长1-2μm,宽0.1-0.2μm。其顶端结构有助于肺炎支原体附着于呼吸道上皮细胞,也是肺炎支原体的靶细胞。由于这些微生物能够在宿主细胞外生存,因此它们被认为是自由生活的生命形式。支原体的基因组大小和菌体维度较小,限制了菌体合成稳定的肽聚糖细胞壁的能力,因此菌体没有肽聚糖细胞壁。支原体感染的发病机制复杂且仍未完全明确。然而,许多研究表明肺炎支原体可能由两种机制致病。首先是直接损伤机制,包括膜融合损伤、黏附损伤、营养缺乏、毒性损伤、侵袭性损伤。第二类是免疫损伤机制,包括体液免疫损伤、炎症损伤、细胞免疫损伤、免疫抑制和抗原免疫损伤。一些研究提出,菌体可通过血液传播到各器官,导致支原体菌血症,易发生肺外并发症。尽管肺炎已被认为是肺炎支原体感染的标志,但该病原体可引起人体几个器官的多种肺外表现,并可因不同形式的感染表现得更复杂。近50年已有重症和爆发性MP感染的病例,但很少见。关于支原体肺炎的肺外并发症,尽管一些研究已经以自身免疫的机制来解释,但非呼吸系统疾病的特异性免疫机制和发病机制还不完全清楚。肺外表现的可能的发病机制可能是一种直接机制,通过该机制,肺炎支原体可以在局部的定居部位诱导炎性细胞因子,或者间接在没有菌体定居的部位引起炎症反应,免疫复合物的形成或自身免疫反应在疾病的进展中起关键作用。科学家已经提出,宿主免疫反应或自身免疫反应在非呼吸系统疾病的发病机制中起作用.肺炎支原体细菌可以在全身不同器官血行传播,其中包括皮肤及血液,并且在感染部位,菌体诱导细胞因子的产生,随后导致直接型肺外表现。此外,血流中肺炎支原体的存在还通过产生趋化因子如肿瘤坏死因子α等和细胞因子,影响血管壁,导致血管炎和血栓形成。另一种可能的机制是肺炎支原体对红细胞的黏附,并且这种黏附过程可能有助于发展为肺外表现。肺炎支原体对红细胞的黏附现象仍在研究之中。支原体感染的临床表现可分为两类:肺部感染和肺外表现。肺炎支原体感染引起各种各样的临床体征和症状,从轻度无症状感染或不明显的呼吸道症状到严重且可能致命的肺炎和肺外表现。肺炎支原体感染可能有不同的临床表现。大多数感染是轻度和自限的。通常,支原体感染在不同年龄组儿童之间临床表现不典型。咳嗽是被认为是MP肺炎标志的最突出的症状,干咳无痰,但年龄较大的儿童的患者可能会出现咳嗽,伴有白色泡沫状粘液或粘液痰。咽炎、气管支气管炎和支气管肺炎是肺炎支原体感染最常见的被熟知的临床特征。大多数情况下,临床症状比体征更严重。感染发展至下呼吸道,初期症状持续,咳嗽逐渐加重,发热加剧,可能出现呼吸困难。约20-25%的肺炎支原体感染患儿可出现肺外表现,包括肝脏,心脏,肾脏,神经系统,肌肉骨骼,心脏和血液系统受累。这些肺外表现可能出现在呼吸系统疾病或肺炎之前,期间,之后或甚至没有呼吸道症状时出现。最常见的肺外表现之一是心脏受累,如心包炎、心肌炎和心包积液。中枢神经系统(CNS)并发症被认为是最严重的肺外表现。此类神经系统并发症包括脑炎、小脑综合征、脑神经麻痹、无菌性脑膜炎或脑膜脑炎、急性播散性脑脊髓炎、昏迷、视神经炎、精神错乱、脑炎、继发于脑炎的急性精神病。在过去的十年中,有学者已经进行了大量的研究,以加强对由肺炎支原体引起的疾病的发病机理、感染谱和临床特征的了解。目前已经开发出许多用于检测和了解该疾病的流行病学和感染的流行病学特征的先进技术,然而,没有单一、可靠的测试是确诊肺炎支原体感染的金标准。最敏感的肺炎支原体感染早期诊断方法是血清学和PCR方法的联合检测。许多研究报道支原体血症存在并容易导致肺外并发症,但报道的支原体血症的发生率存在差异。2005年,Daxboeck在研究中认为,肺炎支原体在相当一部分支原体肺炎患者的血液循环中存在,并认为支原体血症的患病率为52%。而国内的一些研究显示支原体血症的患病率较之明显低。2010年,王洪波在研究中发现肺炎支原体在血清中的检出率为20.8%;2013年,赵琪林在研究中发现肺炎支原体在血清中的检出率为36.5%;李海平等研究中的检出率为31.7%。因此,本研究旨在通过血液RT-PCR检测来证实支原体肺炎患者支原体菌血症的存在并研究其发生率。目的:首先,本研究旨在通过血清学(Ig G阳性病例)来诊断为支原体肺炎的患者中支原体血症的患病率。其次,比较两种不同血液标本(血浆和从白细胞中提取的淋巴细胞)中的支原体肺炎DNA PCR阳性率。最后,该研究旨在比较血液PCR阳性患者(肺炎支原体血症)和阴性的肺炎支原体肺炎患者之间的临床表现的差异(包括年龄差异,退热时间,住院时间和并发症)。方法:本研究于2018年1月至2018年5月在吉林大学第一医院小儿呼吸进行。研究对象为以血清学标准确诊支原体肺炎的患儿。采用颗粒凝集法(Serodia-Myco II试剂盒)检查抗肺炎支原体的抗体(Ig G),Ig G滴度≥1:160认为是阳性。采集入组患儿的血液样本,并将这些样本送至吉林大学第一医院基因诊断中心分子生物学实验室检测。用MP DNA检测试剂盒(PCR荧光探针法)提取血浆和WBC的MP DNA(从WBC分离的淋巴细胞)。使用MP PCR荧光诊断试剂盒通过实时PCR扩增这些样品(血浆和WBC)中可能存在的肺炎支原体DNA。最后,比较血液PCR阳性患者(支原体血症)和PCR阴性支原体肺炎患者之间的临床特征的差异,发热时间,疾病状况的严重程度,并发症和实验室检查结果以及影像学表现。采用IBM SPSS statistics 18进行统计学分析。结果:以血清学试验为标准共有75名确诊支原体肺炎的患儿参加研究。从这些患儿获得的血样进行实时PCR以检测肺炎支原体DNA。在53.33%(40/75)全血样品中检测到MP DNA。血浆样本阳性率为47.5%(19/40),淋巴细胞样本阳性率25%(10/40),两者均阳性的病例占27.5%(11/40)。肺炎支原体DNA阳性组与阴性组相比,年龄(p=0.245),性别(p=0.432),退热时间段(p=0.565)的差异无统计学意义,两组之间的住院时间有统计学意义(p=0.042)。肺炎支原体DNA阳性组的平均住院时间为(9.75±3.04)天,长于肺炎支原体DNA阴性组的平均住院时间(7.88±2.05)。因此,患者的平均住院时间在2组中有统计学差异。实验室检查包括WBC(p=0.854)、嗜中性粒细胞(p=0.058)、单核细胞(p=0.214)、红细胞(RBC)(p=0.316)、血小板(p=0.134)、肌酸激酶(CK)(p=0.246)、肌酸激酶同工酶CKMB(p=0.417)、乳酸脱氢酶(p=0.161)),肺炎支原体DNA聚合酶链反应阳性组与阴性组之间的差异无统计学意义。本研究中,CRP水平在两组之间是有统计学意义的(p=0.004),肺炎支原体阳性组的CRP水平(37.82±70.70)要明显高于肺炎支原体阴性组(13.59±17.89)。此外,本研究发现AST与ALT水平在两组之间有统计学差异。在肺炎支原体阳性组,AST水平(54.03±63.48)高于阴性组(36.93±12.57),ALT水平(33.44±38.22)高于阴性组(21.11±14.82)。从上述统计分析结果来看,在肺炎支原体DNA阳性组,59.45%(22/37)的患者存在肺/肺外并发症。24.33%(9/37)的患者存在急性心肌损伤,这是本组最为普遍的并发症。胸腔积液的患者有13.51%(5/37),而8.10%(3/37)的患者存在急性肝损伤。在肺炎支原体DNA阴性组中,只有38.23%(13/34)的患者合并肺部/肺外并发症,最普遍的并发症是急性心肌损伤17.64%(6/34),之后是胸腔积液5.82%(2/34)。结论:本研究显示肺炎支原体患者血阳性率较高,阳性者住院时间长,CRP更高,AST、ALT水平更高,并发症发生率更高。虽然仅研究了少量支原体肺炎的样本,但采用血液PCR方法可以得到有用的数据。这将有助于我们了解肺炎支原体菌血症的患病率以及肺炎支原体血症与肺外并发症之间的关系。应进行更大规模的研究以评估支原体菌血症的血液PCR检测诊断,并为PCR(血浆,血清或全血)选择适当的血液检测标本。