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第一章肝细胞癌组织中Ezrin和CD44表达的相关性研究目的：了解Ezrin蛋白、CD44蛋白与肝细胞癌临床病理特征、淋巴结转移的关系。方法：本研究应用免疫组化法(SP法)检测Ezrin蛋白、CD44蛋白在70例肝癌的表达情况,并对它们在病理类型、临床分期、分化程度及淋巴结转移的不同表达进行对比分析。结果：1、Ezrin蛋白、CD44蛋白定位于细胞浆；2、Ezrin蛋白在有淋巴结转移的肝癌中阳性率(97.67%)显著高于无转移者(74.07%)(P<0.05),提示Ezrin蛋白表达与淋巴结转移有显著相关性。与患者年龄,性别,肿瘤大小无关均无显著相关性；3、CD44蛋白阳性表达与淋巴结转移有显著相关性(P<0.05),有淋巴结转移(100%)的阳性率要显著高于无淋巴结转移(81.48%)的阳性率。与临床分期无显著相关性；4、在肝细胞肺癌中,Ezrin蛋白与CD44蛋白阳性表达呈正相关(P<0,05)。结论：1、Ezrin蛋白和CD44在肝癌组织中高表达,两者表达呈正相关；2、Ezrin蛋白在肝细胞癌中的表达与TNM分期和病理分级有关,与有无复发和转移有关,而与其他因素均不相关；3、CD44在肝细胞癌中的表达与与肝癌转移与否有关,而与其他因素均不相关；4、联合检测Ezrin和CD44的表达有助于综合判断肝癌的恶性程度和转移潜能,为基因靶向治疗提供理论依据。第二章特异性下调Ezrin对肝细胞癌侵袭和转移的影响及其作用机制目的：应用小干扰RNA(siRNA)技术特异性下调Ezrin在肝癌细胞株HepG2中的表达,探讨Ezrin在肝细胞癌侵袭和转移中的作用及分子机制。方法：通过siRNA技术特异性下调人肝细胞癌细胞株HepG2中Ezrin的表达,应用Transwell法和划痕法对肝细胞癌侵袭、转移能力的改变进行分析；应用免疫印迹技术检测E-钙钻素,N-钙钻素和波形蛋白(Vimentin)的表达。应用细胞黏附实验和细胞伸展实验观察特异性下调Ezrin对细胞黏附特性和细胞极性形成的影响；应用明胶酶谱实验检测基质金属蛋白酶(MMPs)的活性；用免疫印迹实验检测细胞外基质重构相关蛋白基质金属蛋白酶-2,9(MMP-2,9)的表达以及转录因子c-jun的表达及磷酸化状态。结果：1、Transwell实验显示Ezrin siRNA转染细胞每个低倍视野细胞数平均为33.8个,明显低于未转染细胞(平均77.6个/低倍视野)和非特异性siRNA转染细胞(平均78.7个/低倍视野),统计学分析表明具有显著性差异(P<0.05)。这表明特异性下调Ezrin可以抑制肝细胞癌的侵袭。划痕法实验结果显示,24h后Ezrin siRNA转染细胞的创口愈合较慢(43.8%),而未转染细胞(94.2%)和非特异性SIRNA转染细胞(89.2%)创口基本愈合。统计学分析表明具有显著差异(P<0.05)；2免疫沉淀实验结果表明,在Ezrin siRNA转染细胞中Src的磷酸化水平明显低于未转染细胞和非特异性转染细胞,统计学分析具有显著差异(P<0.05)；免疫印迹实验结果表明在Ezrin siRNA转染细胞、未转染细胞和非特异性转染细胞中,Src的表达没有差异(P>0.05)。以上结果表明特异性下调Ezrin表达可以抑制Src的磷酸化。在Ezrin siRNA转染细胞中N-黏钙素、波形蛋白的表达明显低于未转染细胞和非特异性转染细胞,而E-黏钙素的表达明显高于未转染细胞和非特异性转染细胞,经统计学分析有显著差异(P<0.05)；3应用细胞伸展实验对Ezrin siRNA转染细胞的极性形成进行研究,结果表明在不同时间点Ezrin siRNA转染细胞的伸展明显落后于非特异性RNA转染细胞和未转染细胞(P<0.05)。应用明胶酶谱技术和免疫印迹技术对Ezrin siRNA转染细胞中MMP-2、MMP-9的表达与活性进行检测,明胶酶谱的实验结果显示Ezrin siRNA转染细胞MMP-2、MMP-9的活性明显低于非特异性转染细胞和未转染细胞；免疫印迹实验结果表明Ezrin siRNA转染细胞中MMP-2、MMP-9的表达明显低于非特异性转染细胞和未转染细胞。应用免疫印迹技术检测转录因子c-jun的表达及磷酸化水平,结果发现在Ezrin siRNA转染细胞中,c-jun的磷酸化水平明显降低,而c-jun的表达没有变化。结论：1、特异性下调Ezrin可以抑制肝细胞癌的侵袭和转移,这种作用是通过抑制上皮-间质转化和参与Src信号转导通路的调节实现的；2、特异性下调Ezrin可以抑制肝癌细胞的黏着斑转换、细胞极性形成和细胞外基质的降解；]Ezrin可作为肝细胞癌治疗的一个重要靶点。第三章吴茱萸碱对人肝癌HepG2Ezrin表达和生物学行为的影响目的：观察吴茱萸碱对HepG2细胞Ezrin表达的影响,探讨吴茱萸碱抗肿瘤作用的可能机制。方法：1、用MTT法观察吴茱萸碱对HepG2细胞增殖的影响；2、用集落形成法观察吴茱萸碱对细胞集落形成的影响；3、通过划痕试验及transwell细胞侵袭试验进一步对吴茱萸碱作用的肝癌细胞迁移和侵袭能力进行分析；4、并用Western Blot和RT-PCR检测吴茱萸碱干预后肿瘤细胞Ezrin蛋白、磷酸化Ezrin蛋白及Ezrin mRNA表达的变化。结果：1、吴茱萸碱抑制HepG2细胞增殖,呈时间和剂量依赖关系,吴茱萸碱作用48小时,IC50约为37.283μM；2、吴茱萸碱影响HepG2细胞的集落形成,呈量效关系；3、细胞划痕实验结果表明药物治疗后肝癌细胞增殖迁移能力受到明显抑制；4、Western Blot和RT-PCR结果显示,吴茱萸碱明显降低Ezrin、磷酸化Ezrin及Ezrin mRNA在HepG2细胞中的表达,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论：1、吴茱萸碱呈时间和剂量依赖性抑制HepG2细胞增殖；2、吴茱萸碱下调Ezrin mRNA和Ezrin蛋白表达及其磷酸化活化,可能成为抗肝癌治疗的新的药物。