香蕉穿孔线虫[Radopholussimilis(Cobb,1893)Thorne,1949]是一种毁灭性的植物病原线虫,被很多国家列入检疫性有害生物名单,也是我国禁止进境的植物检疫有害生物。由于香蕉穿孔线虫为害的严重性,有效的检疫是阻止其扩散蔓延,减少其为害和降低经济损失的最有效措施之一。因此加强对可能携带该线虫的植物种植材料及其粘附的土壤或其他栽培基质的检测至关重要。应用传统的形态学方法检测鉴定香蕉穿孔线虫的过程繁琐、复杂、耗时,当虫量较少时,分离检测出目标线虫比较困难,并且要求检测人员具备熟练的植物线虫分类知识和经验。因此,迫切需要研究建立能够准确快速检测鉴定香蕉穿孔线虫的分子生物学技术。　　 本论文研究了直接从多种线虫混合样品、香蕉和红掌根组织样品以及土壤和基质样品中检测鉴定香蕉穿孔线虫的PCR方法。具体研究结果如下:　　 1.使用Primer Primier5.0在香蕉穿孔线虫的ITS区设计一对特异引物,对17种线虫24个种群单条线虫分别进行PCR扩增,只有来自香蕉穿孔线虫7个种群的DNA样品扩增出约500 bp的特异性条带,而其它10种线虫的17个种群的DNA样品没有扩增条带出现,表明所设计的引物对香蕉穿孔线虫DNA具有很好的特异性,从而建立了单条香蕉穿孔线虫的检测鉴定方法。　　 2.使用所设计的特异引物和建立的PCR反应体系和程序,分别扩增1条香蕉穿孔线虫与3组其它多种线虫混合的样品DNA,分别获得大小约500 bp的特异性条带。表明所设计的引物同样可以特异性地检测出混合在多种线虫中的单条香蕉穿孔线虫,从而建立了混合线虫样品中香蕉穿孔线虫的检测鉴定方法。　　 3.使用设计的特异引物和建立的PCR反应体系和程序,扩增2cm长(约0.1g)的红掌和香蕉根分别与10条、5条、3条、2条和1条香蕉穿孔线虫混合后的DNA样品,结果从含有10条、5条和3条香蕉穿孔线虫的混合DNA模板中,扩增出了约500 bp的特异性条带。因此,采用所设计的香蕉穿孔线虫特异引物和建立的DNA提取方法及PCR体系,可以稳定地直接从每克植物组织中含不少于30条香蕉穿孔线虫的植物样品中检测出该线虫。此外,从感染香蕉穿孔线虫的0.1g香蕉和红掌病根组织提取的DNA,分别用设计的香蕉穿孔线虫特异性引物和建立的PCR反应体系和程序,进行PCR扩增,均扩出大小约500 bp的特异性条带。因此,采用本研究所设计的香蕉穿孔线虫特异引物以及建立的DNA提取方法及PCR体系,可以稳定地直接从植物病组织中检测出该线虫,从而建立了在植物组织样品中香蕉穿孔线虫的检测鉴定方法。　　 4.在0.5g土壤和0.5g基质中分别加入若干条香蕉穿孔线虫,使用所设计的特异性引物和已报道的DNA提取与纯化方法,最终可以在0.5g土壤或基质中加入1条香蕉穿孔线虫的样品中成功扩增出大小约500 bp的特异性条带。表明采用本研究所设计的香蕉穿孔线虫特异引物以及建立的DNA提取与纯化方法及PCR体系,可以稳定地直接从土壤或基质中检测出该线虫,从而建立了在土壤和基质样品中香蕉穿孔线虫的检测鉴定方法。　　 5.根据Genbank中香蕉穿孔线虫的基因序列,设计筛选合成了特异性引物和TaqMan探针,构建了香蕉穿孔线虫实时荧光PCR检测鉴定体系,在混合线虫样品和植物组织样品中快速准确地检测出香蕉穿孔线虫,从而建立了香蕉穿孔线虫实时荧光PCR检测鉴定方法。　　 本研究建立了利用常规PCR和实时荧光PCR,直接从多种线虫混合样品以及植物组织样品中检测鉴定香蕉穿孔线虫的方法;并建立了利用常规PCR,直接从土壤和基质样品中检测鉴定香蕉穿孔线虫的方法,实现了真正意义的香蕉穿孔线虫分子快速检测鉴定,为香蕉穿孔线虫的快速检测提供了新方法,满足了口岸检疫部门对香蕉穿孔线虫进行快速、准确检测鉴定的要求,对阻止该线虫的侵入和扩散、对保护我国农业生产安全的安全具有重要意义。