余甘子主要含有酚类、鞣质类、萜类、黄酮类等成分,具有抗氧化、抗肿瘤、抗病毒,降血糖等突出的药理活性。药动学包括药物的吸收、分布、代谢和排泄（ADME）四个方面。其中吸收、分布和排泄直接决定于药物的跨膜/跨细胞转运。因此药物的跨膜/跨细胞转运是药动学研究首先要解决的核心问题。药物跨膜/跨细胞转运机制依赖于建立合适的药物体外吸收模型。来源于人结肠癌细胞的Caco-2细胞系和来源于狗肾近曲小管上皮的MDCK细胞系,是国际上研究药物跨细胞转运机制的常用模型细胞。本论文结合课题组余甘子鞣质部位药动学研究,建立Caco-2细胞模型,采用LC-MS方法探讨余甘子鞣质部位中的3个主要成分没食子酸、柯里拉京和鞣花酸在Caco-2细胞模型中的透过情况,并对它们的跨细胞转运特点和机制进行研究,为余甘子鞣质部位药动学研究提供依据。血栓通胶囊可活血祛瘀、通脉活络,在心脑血管疾病的防治中应用广泛,主要成分为三七总皂苷,其作用与抑制血小板的聚集作用密切相关。本实验考察了二磷酸腺苷、胶原和凝血酶三种诱导剂作用下血小板聚集的稳定性。基于抑制血小板聚集活性,优选了诱导剂及标准对照物质,建立了生物效价检测方法,为血栓通胶囊生物评价提供参考,并进一步补充完善血栓通胶囊的质量控制方法。本文共分为四章:第一章文献综述余甘子又名“庵摩勒”,来源于大戟科（Euphorbiaceae）叶下珠属植物Phyllanthus emblicaL.的干燥成熟果实,广泛分布于热带亚热带的亚洲国家,如中国、印度、泰国、伊朗等[1-2]。余甘子为药食两用药物,拥有悠久的药用与食用历史,陈藏器在其所著的《本草拾遗》中写道:“人食其子,先苦后甘,故曰余甘”。在我国,中医以及藏医均对余甘子有较广泛的运用,中医主要用于清热,治疗喉咙肿痛,咳嗽等;藏医主要用于治疗血病和胆病。早在唐代余甘子就作为一种饮品而广受欢迎。本章总结了余甘子在世界范围内的传统应用,化学成分以及近几年的药理作用研究。Caco-2细胞模型由于其易于操作,重复性好,近年来被广泛用于单体成分及中药提取物的吸收研究中,并可用于新药开发早期阶段对于药物吸收特性的初筛。本章总结了Caco-2细胞模型的基本特点、药物转运途径以及在口服吸收中的应用。生物效价检测提供了药品与临床疗效一致的生物活性的信息,随着中药质量化学成分控制以及相应药理学研究的深入,新评价模式研究的逐渐开展,建立与临床应用相关联的动物模型和体外活性评价方法,生物效价检测也逐渐应用于中药领域。本章总结了生物效价的基本含义,监测指标和对照品的选择并总结了生物活性测定在中药质量控制中的应用。第二章余甘子鞣质部位在Caco-2细胞模型的透过第一节 Caco-2细胞模型的建立及验证本部分建立了一套培养Caco-2细胞模型的方法,并对Caco-2细胞模型中紧密连接标志物的透过以及跨膜电阻等进行验证,最终建立稳定的细胞转运模型。结果表明细胞模型的TEER（跨膜电阻）值在培养前12天呈逐渐上升趋势,在13-21天趋于稳定。在第21天时细胞连接紧密,无破损,TEER值大于500 Ω/cm2。难吸收标志物荧光素钠的Papp（表观渗透系数）值为3.16±0.25 × 10-7cm/s,符合相关要求。考察了不同厂家HBSS（Hank’s平衡盐溶液）缓冲液及胎牛血清对Caco-2细胞模型在转运过程中的电阻值影响,最终选择Gibco公司的产品以保持细胞模型的稳定;当以荧光素钠透过细胞模型的表观渗透系数作为参考,电阻值不小于500 Ω/cm2时,转运时间在3小时内,Caco-2细胞模型的稳定性良好。第二节余甘子提取物在Caco-2细胞模型中的透过研究建立了余甘子提取物中没食子酸、柯里拉京和鞣花酸在Caco-2细胞模型中LC-MS定量分析方法。发现三者在Caco-2细胞模型中的透过较低,Papp值均小于1×10-6 cm/s,属于难吸收成分,透过的主要限制因素为细胞间的紧密连接。外排蛋白P-gp和MRPs可能参与了柯里拉京与没食子酸的吸收,正向转运蛋白OATP和SGLT1可能参与了鞣花酸的吸收。三种成分在单体、单体混合物、提取物状态下,表观渗透系数各不相同,这可能是由于不同状态下不同转运蛋白对三种成分的摄取状况不同。第三节余甘子中多酚类成分在HBSS溶液中稳定性考察余甘子中没食子酸、柯里拉京和鞣花酸及其单体在HBSS溶液中不稳定,但是混合物的稳定性稍高于各个单体的稳定性。没食子酸、柯里拉京和鞣花酸在HBSS中呈不稳定状态可能是由于鞣质的水解和多酚类成分在弱碱性HBSS缓冲液中容易氧化分解。所以样品尽量保持干燥固体状态,在溶液中应尽快测定。考虑到在转运过程中药品要与HBSS缓冲液接触,可用此稳定性数据对测得数据进行校正,以期得到相对准确数据。比较校正前后的数据发现,水解矫正后数据大小有所改变,但其趋势变化不大。但矫正后三种成分在单体、单体混合物、提取物状态下,表观渗透系数均呈现先下降后上升的趋势。第四节没食子酸、柯里拉京和鞣花酸单体在Caco-2细胞模型中的代谢研究使用LC-MSn定性分析方法检测没食子酸、柯里拉京和鞣花酸在Caco-2细胞模型中透过后成分的变化。Caco-2细胞模型建成后加入余甘子提取物及没食子酸、柯里拉京和鞣花酸单体成分,发现没食子酸、柯里拉京和鞣花酸在Caco-2细胞模型中的透过较低,于液质总离子流图中检测不到明显的色谱峰,但能从鞣花酸及柯里拉京的透过样品中提取到鞣花酸的标志性代谢产物尿石素A。第四章测得三种成分在细胞模型中透过率较低,一部分原因可能在透过的过程中有分解和代谢。第三章血栓通胶囊的质量控制研究第一节血小板聚集测定的稳定性分析采用北京泰利康信血小板聚集仪（LBY-NJ4）,用质控液考察仪器本身与常规操作引起的稳定性,用同一富血小板血浆（PRP）考察不同诱导剂下的血小板聚集参数的稳定性。质控液检测结果表明,血小板最大聚集率和曲线下面积的RSD均小于3%。在二磷酸腺苷（ADP）、胶原和凝血酶三种诱导剂作用下,血小板最大聚集率,聚集曲线下面积的RSD均小于4%和10%。凝血酶作用下的聚集达峰速率不稳定,RSD=24.45%。对于ADP和胶原诱导的血小板聚集,聚集参数稳定性较好,适合用于药效学评价或临床病程观察。对于凝血酶诱导的血小板聚集,建议使用最大聚集率和聚集曲线下面积进行药效评价。第二节基于抑制血小板聚集活性的血栓通胶囊质量控制研究基于血栓通胶囊抑制血小板聚集活性,选择凝血酶作为血小板聚集的诱导剂,注射用血塞通作为标准对照物质。发现血栓通胶囊对凝血酶诱导的血小板聚集具有显著抑制作用,并且呈现出剂量依赖关系。利用“量反应平行线”法,建立测定血栓通胶囊的血小板聚集抑制作用的生物效价检测方法,结果显示样品检测结果均能通过可靠检验且重复性较好,RSD=2.92%。该研究建立的生物效价检测方法可以作为血栓通胶囊生物评价的质控方法之一。第四章总结与讨论Caco-2细胞模型培养第21天时细胞连接紧密,无破损,TEER值大于500 Ω/cm2。难吸收标志物荧光素钠的Papp值为3.16±0.25 ×10-7cm/s,符合相关要求。选择Gibco公司的HBSS缓冲液及胎牛血清用于模型培养;当以荧光素钠透过细胞模型的表观渗透系数作为参考,电阻值大于500Ω/cm2时,转运时间在3小时内,Caco-2细胞模型的稳定性良好。余甘子提取物浓度为1 mg/mL、没食子酸浓度为45 μg/mL,柯里拉京浓度为16μg/mL,鞣花酸浓度为36μg/mL及三种单体混合物对Caco-2细胞无抑制作用,可用于Caco-2细胞模型实验。建立余甘子提取物透过Caco-2细胞模型样品的LC-MS定量分析方法:没食子酸:保留时间4.14 min,定量离子对选用m/z 169.0→125.0（碰撞能量,-10 eV）,线性回归方程 Y=28.769X+22.697（r=0.9999）,线性范围 1.01 ng/mL-252 ng/mL,最低检测限为0.08 ng/mL,最低定量限为1.64 ng/mL。柯里拉京:保留时间6.61 min,定量离子对选用m/z 633.1→301.0（碰撞能量,-35 eV）,线性回归方程 Y=23.705X-26.106（r=0.9999）,线性范围 0.65 ng/mL-653 ng/mL,最低检测限为1.35 ng/mL最低定量限为1.94 ng/mL。鞣花酸:保留时间8.39 min,定量离子对选用m/z 301.0→301.0（碰撞能量,-10 eV）,线性回归方程 Y=111.21X+130.99（r=0.9982）,线性范围 1.98 ng/mL-989 ng/mL,最低检测限为0.17 ng/mL,最低定量限为0.97 ng/mL。余甘子提取物中没食子酸、柯里拉京和鞣花酸的Papp值均小于1×10-6 cm/s,属于难透过成分,透过的主要限制因素为细胞间的紧密连接。余甘子提取物中三种成分的透过及其机制:没食子酸三小时内的表观渗透系数为0.014-0.038×10-6cm/s,属于难吸收成分,其透过可能有P-gp和MRPs蛋白的参与。柯里拉京三小时内的表观渗透系数为0.080-0.147×10-6cm/s,属于难吸收成分,其透过可能有P-gp和MRPs蛋白的参与。鞣花酸三小时内的表观渗透系数为0.406-0.676×10-6cm/s,属于难吸收成分,其透过可能有OATP和SGLT1蛋白的参与。没食子酸及柯里拉京单体在HBSS溶液中极不稳定（9.45-24.97%）,当与其他两种单体混合时,其稳定性大幅提高（>49.95%）,当处于余甘子提取物中,稳定性进一步提高（>52.22%）。鞣花酸单体及单体混合物则相对保持稳定状态,而当处于余甘子提取物中,含量上升约20%。LC-MSn法可测得鞣花酸的代谢产物尿石素A,可推测鞣花酸的代谢也是引起其吸收程度低的原因。考察ADP、胶原和凝血酶诱导血小板聚集的多种参数的稳定性,其中最大聚集率参数稳定性最好,均小于4%。血栓通胶囊可以抑制由ADP、胶原和凝血酶诱导的血小板聚集,且此抑制呈现出剂量依赖性,且线性关系良好。当使用ADP作为诱导剂时药效作用对于药物浓度变化不敏感,而当使用胶原作为诱导剂时测量结果变差较大,最终选择凝血酶作为最佳血小板聚集诱导剂,用于测定血栓通胶囊抑制血小板聚集的效价。当使用阿司匹林作为标准对照物质时,效价测定不能通过可靠性检验,而当使用三七总皂苷作为标准对照物质时测量结果变差较大,最终注射用血塞通作为最佳标准对照物质,用于测定血栓通胶囊抑制血小板聚集的效价。六次测得效价值相差较小,RSD=2.92%,当使用BS2000软件对六次测得结果进行合并计算,得到效价为92.04 U/mL,FL=3.89%,可信限范围88.53-95.69 U/mL。创新点1.建立余甘子提取物透过Caco-2细胞模型样品的LC-MS定量分析方法。2.阐明了余甘子提取物中没食子酸、柯里拉京和鞣花酸属于难透过成分,没食子酸和柯里拉京的透过可能有P-gp和MRPs蛋白的参与,鞣花酸的透过可能有OATP和SGLT1蛋白的参与。3.LC-MSn法测得鞣花酸的代谢产物尿石素A,推测鞣花酸的代谢是引起其吸收程度低的原因之一。4.建立血栓通胶囊体外抑制血小板聚集的效价测定方法,测量结果稳定RSD=2.92%,可作为血栓通胶囊的质控方法之一。