【摘 要】
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酱油是中国传统的调味品之一,因其滋味鲜美、酱香浓郁的特点而广受消费者的青睐,其独特的咸鲜感和浓厚感是衡量酱油品质的重要指标。近年来,检测技术的进步促使发酵食品中多种新型呈味物质的检出,比如核苷酸、呈味肽、肽类衍生物等。本团队前期在酱油中发现一类具有潜在浓厚味贡献的氨基酸衍生物——乳酰基氨基酸,然而关于酱油中该类物质的研究报道较少。因此本论文研究了酱油发酵过程中乳酰基氨基酸的演变规律,筛选关键乳酰基
【基金项目】
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国家自然科学基金面上项目（31972065）； 广东省自然科学基金区域联合基金项目（2019B1515120053）；
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酱油是中国传统的调味品之一,因其滋味鲜美、酱香浓郁的特点而广受消费者的青睐,其独特的咸鲜感和浓厚感是衡量酱油品质的重要指标。近年来,检测技术的进步促使发酵食品中多种新型呈味物质的检出,比如核苷酸、呈味肽、肽类衍生物等。本团队前期在酱油中发现一类具有潜在浓厚味贡献的氨基酸衍生物——乳酰基氨基酸,然而关于酱油中该类物质的研究报道较少。因此本论文研究了酱油发酵过程中乳酰基氨基酸的演变规律,筛选关键乳酰基氨基酸,并针对其合成技术、呈味特性和形成途径展开系统的研究,主要研究内容如下:（1）基于超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱技术（UPLC-Q-TOF-MS）对酱油发酵过程中的代谢产物进行分析,共鉴定得到31种氨基酸衍生物,其中包括7种乳酰基氨基酸。其峰面积在酱油发酵第15～30天之间增长速率最快,并于发酵第90天达到峰值,与乳酸的含量变化呈高度正相关（r=0.88～0.99）。通过采用正交偏最小二乘法判别分析（OPLS-DA）方法筛选得到8种关键差异氨基酸衍生物（VIP＞1）,其中VIP值排列前3的物质分别为N-乳酰基异亮氨酸（Lac-Ile）（5.66）、N-乳酰基亮氨酸（Lac-Leu）（4.22）、N-乳酰基苯丙氨酸（Lac-Phe）（3.71）。（2）利用优化后的酶促反应条件,合成VIP值排列前3的关键差异乳酰基氨基酸,并对其滋味进行感官评价。结果发现,在亮氨酸:乳酸=1.5:1（n:n）的底物溶液中加入谷氨酰胺转氨酶,p H=7和温度50℃下反应18 h为最适反应条件。对3组（Lac-Leu、Lac-Ile和Lac-Phe）反应前后溶液的滋味特点进行研究,发现相对于空白样品,生成LacLeu的溶液单独品评和加入酱油均表现出增强浓厚感和持久感的效果。使用亲水相互作用色谱技术分离纯化Lac-Leu,并进行呈味特性分析。发现Lac-Leu分离纯化冻干物呈酸味和苦味,并有一定的收敛感,当溶解于含有盐和味精的水溶液中可以提升原溶液浓厚感。使用滋味稀释分析法（TDA）和比较滋味稀释分析法（c TDA）测定Lac-Leu的阈值和增鲜阈值,结果分别为0.08 mg/m L和0.16 mg/m L。（3）从来源于酱醪中的10种细菌和12种酵母菌中筛选可合成乳酰基氨基酸的主导微生物,并研究其对不同氨基酸的利用偏好性。结果发现10种细菌无法合成目标物,而6种酵母菌（埃切酵母、粉状米勒氏酵母、山梨假丝酵母、拟平滑假丝酵母、近平滑假丝酵母、似平滑假丝酵母）在底物溶液中培养可生成乳酰基氨基酸。其中拟平滑假丝酵母、近平滑假丝酵母、粉状米勒氏酵母在发酵过程中OTU相对丰度与各类乳酰基氨基酸的含量变化呈正相关（r＞0.8）。（4）进一步研究拟平滑假丝酵母、近平滑假丝酵母、似平滑假丝酵母和粉状米勒氏酵母合成乳酰基氨基酸的形成条件,推测参与乳酰基氨基酸合成的关键酶。对比上述4种酵母菌细胞破碎液及胞外培养基液在底物溶液中合成Lac-Leu的情况,结果发现4种酵母菌主要通过胞内酶合成乳酰基氨基酸,最适合成条件范围为p H=5～7,温度为50～60℃。通过局部比对算法搜索工具（blastp）搜索比对,发现4种酵母菌中均有与胞质非特异性肌肽酶2（CNDP2）相似度大于50%的蛋白质序列,推测4种酵母菌的胞内存在与CNDP2有类似功能的酶,可以催化乳酰基氨基酸的合成。（5）上述4种酵母菌可以促使乳酸与6种非极性氨基酸（Val、Leu、Ile、Met、Phe、Trp）、3种中性氨基酸（Thr、Cys、Tyr）、3种碱性氨基酸（Lys、His、Arg）合成对应的乳酰基氨基酸,假丝酵母属还能与谷氨酸（Glu）合成乳酰基谷氨酸。对比各乳酰基氨基酸的峰面积,发现4种酵母菌趋向于利用非极性氨基酸与乳酸进行合成反应,其中所合成的Lac-Phe、Lac-Leu和Lac-Ile的峰面积大小名列前3,与酱油中所检测到的峰面积趋势类似。
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