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5-烯醇式丙酮莽草酸-3-磷酸合酶EPSPS(5-enolpyruvyl-shikimate-3-phosphate synthase,EPSPS:EC 2.5.1.19)是莽草酸途径中的关键酶,能够催化PEP(磷酸烯醇式丙酮酸)与SP3(莽草酸-3-磷酸)生成EPSP(5-烯醇式丙酮莽草酸-3-磷酸),为芳香族氨基酸的合成提供前体物质,该酶广泛地存在于微生物及高等植物体内。由于EPSPS是除草剂草甘膦的靶标酶,所以筛选高抗草甘膦EPSPS新基因的研究工作被广泛展开,来自根癌农杆菌(Agrobacterium sp.)CP4菌株的EPSPS对高浓度的草甘膦表现出非常高的抗性,此后该基因被广泛地应用于多种作物的转基因研究中,截止2010年,包括大豆、玉米、油菜、棉花、甜菜和苜蓿等,播种面积近8930万公顷的转基因作物中都含有该抗除草剂基因。面对大量含有CP4-EPSPS转基因的作物或食品进口我国,建立科学的检测方法尤为迫切。虽然现在市场上有多种用于转基因蛋白质测定的试剂盒,但不同厂商采用不同的工艺表达以及方法确定参考物质的量值,无法溯源到上一级的计量标准,造成测定结果不准确和缺乏可比性,由此给生物安全监管带来隐患,并产生一系列法律、贸易等经济和社会问题。为获得稳定来源并且具有高纯度的CP4-EPSPS蛋白,本研究首先构建了CP4-EPSPS的细菌表达载体,并首次实现此基因在大肠杆菌BL21(transtta)菌种中的表达。超声波破碎菌体后,发现该重组蛋白并未以包涵体形式存在于细胞质中,而是以可溶的形式存在于细胞破碎上清液中,为下游的蛋白纯化工作带来极大的便利,通过二步镍柱亲和层析后,CP4-EPSPS重组蛋白的纯度可达99.9%以上,符合作为标准物质的要求。为验证所提纯的CP4-EPSPS蛋白做为标准物质的可行性,本文构建了CP4-EPSPS植物表达载体,通过组培的方法,获得了49株检测为阳性的烟草苗。经过Elisa验证16株烟草有明显的表达。以提纯的CP4-EPSPS蛋白做为标准物质,稀释成不同的浓度,成功的绘制了标准品蛋白的标准吸光曲线。取三株较高表达的烟草为检测对象,利用绘制的标准曲线,能够检测到三株烟草外源蛋白的表达水平。利用上述蛋白表达和纯化体系,已可规模化和标准化生产CP4-EPSPS重组蛋白,并及时提供给北京理工大学和国家计量研究院等合作单位,以便开展更进一步的研究工作。