细胞周期的运转是一个有序的基因调控过程，需要各个细胞事件之间的密切协调。不能正常完成一个细胞周期的细胞将进入程序化死亡或发生癌变。正确退出有丝分裂，完成胞浆分离之前必需确保已经完成正确的染色体分离和纺锤体解聚。Cdc14(Cell division cycle gene 14，细胞分裂周期基因14) 蛋白是一种双特异性丝/苏氨酸磷酸酶，在MEN(Mitotic Exit Network)和FEAR(CdcFourteen Early Anaphase Release)两个网络的调控下获得激活，使一些重要的Cdk底物去磷酸化，从而使芽殖酵母细胞退出有丝分裂。哺乳动物细胞调控有丝分裂退出的机制目前还没有阐明。人类存在着两种Cdc14的同源物，分别称为hCdc14A和hCdc14B。目前的研究表明它们和微管聚合、中心体复制、染色体分离、胞质分裂等多个细胞事件均有关系。了解有丝分裂，阐明细胞周期需要进一步明晰它们的调控网络。本课题组拟用酵母双杂交系统筛选hCdc14A的相互作用蛋白，并且深入研究1～2个有关基因和蛋白质，阐明其与hCdc14A的相互关系和在细胞周期中的功能。 第一部分：酵母双杂交筛选hCdc 14A的相互作用蛋白。 目的: 用酵母双杂交系统筛选hCdc14A的可能相互作用蛋白。 方法： 基本按Clontech公司提供的说明进行：PCR得到hCdc14A基因全长，构建重组质粒pGBKT7-hCdc14A；测序验证读码框和接入片段的正确性；验证hCdc14A是否有自激活报告基因的能力：Western-Blot验证hCdc14A在酵母中的表达；验证人testiscDNA文库的酵母转化效率；顺序转化hCdc14A和人testis cDNA文库到酵母AH109细胞，然后在3缺培养基(缺色氨酸、亮氨酸、组氨酸)上挑取在该培养基上生长的克隆，转四缺培养基(缺色氨酸、亮氨酸、组氨酸、腺氨酸)，利用x-α-gal检测这些克隆是否表达LacZ报告基因；从阳性的酵母中提取文库质粒，与pGBKT7-hCdc14A共转AH109细胞验证蛋白间相互作用；测序得到阳性克隆质粒基因序列；数据库序列比对(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/.)。 结论： 用酵母双杂交系统共筛查出23个可能的hCdc14A相互作用蛋白，包括细胞周期相关蛋白、泛素化相关蛋白、细胞骨架蛋白，为进一步研究hCdc14A的蛋白作用网络打下了基础。 第二部分：hCdc14A的磷酸酶活性受分子内作用调控。 目的: 剖析 hCdc14A 功能域片段和全长的细胞学特征和磷酸酶活性。 方法： PCR克隆hCdc14A基因全长和功能域各片段；将各段构建到绿色荧光真核表达载体pEGFP-C2，利用荧光显微镜观察各片段在Hela细胞周期中的定位，并且观察各段过表达对细胞周期表型的影响；流式细胞仪检测细胞周期；Pulldown试验和免疫共沉淀试验验证各片段之间的相互作用；用MFP蛋白磷酸酶活性检验试剂盒检测磷酸酶活性。 结论： hCdc14A的C端可以抑制N端的磷酸酶活性，提示hCdc14A的磷酸酶活性受分子内作用调控。 第三部分：Plk1磷酸化hCdc14A并且调节hCdc14A的磷酸酶活性。 目的: 探讨hCdc14A与Plk1的相互作用和功能联系。 方法： 构建GFP-hCdc14A和FLAG-Plk1的表达载体，观察hCdc14A与Plk1在Hela细胞中的定位情况；Pulldown和免疫共沉淀试验验证相互作用；荧光显微镜下观察过表达Plk1、hCdc14A野生型，磷酸化和非磷酸化突变体对Hela细胞有丝分裂的影响；动态实时荧光显微镜下观察各突变体对Hela细胞周期的影响；体外磷酸化试验验证Plk1对hCdc14A的磷酸化作用；MFP磷酸酶活性检验试剂盒检验hCdc14A磷酸化突变体的磷酸酶活性。 结论： Plk1可以磷酸化hCdc14A，并增强它的磷酸酶活性，此作用可能是释放了C端对N端的磷酸酶活性抑制作用所致。