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目的:优化细胞膜色谱柱的制备条件,建立新型细胞膜色谱模型。以细胞膜色谱为工具考察中药黄连、黄精配伍中具有改善胰岛素抵抗作用的成分,确定黄连黄精配伍的药效物质。方法:1、探讨黄连、黄精及其二者配伍的降血糖活性。2、考察离体细胞膜的保存方法,选用BCA蛋白浓度测定法考察细胞膜在固定相磁性微球表面的最适吸附平衡量以及吸附平衡时间,进一步优化细胞膜色谱的制备条件。3、建立胰岛细胞膜磁性微球-离线UPLC模型、HepG2细胞萃取-离线UPLC模型以及3T3-L1脂肪细胞萃取-离线HPLC模型,并采用上述色谱模型分析中药黄连、黄精中具有改善胰岛素抵抗作用的药效物质。4、通过胰岛素抵抗3T3-L1脂肪细胞葡萄糖消耗实验,验证细胞膜色谱模型筛选得到的化合物的活性。结果:1、中药黄连、黄精提取液的药理结果表明,黄连组、黄精组与模型组比较均可增加胰岛素抵抗3T3-L1脂肪细胞对葡萄糖的利用率(P<0.01);黄连组及黄精组的细胞上清中的游离脂肪酸浓度均明显降低,与模型组比较存在显著性差异(P<0.01)。2、稳定性试验表明,0.9%NaCl,1%BSA组成的稳定剂在0-9 h内可延缓细胞膜表面ATP酶活性的衰减,这保证了细胞膜受体与活性物质结合、发挥分离作用的物质基础。3、通过细胞膜与磁性微球吸附量以及吸附时间的考察,得知细胞膜初始蛋白浓度为1.2 mg/m L,制备时间为6 h。4、通过将胰岛细胞膜与毛细管结合制备细胞膜毛细管色谱模型,该模型可减少靶细胞膜的用量,同时将细胞膜与磁性微球结合制备胰岛细胞膜磁性微球-离线色谱模型,用于“垂钓”中药黄连、黄精中的降血糖活性物质。结果表明,与传统方法相比,将细胞膜固定于磁性微球表面“垂钓”中药中活性物质,结合色谱质谱分析物质结构的方法,无需填充色谱柱,平衡色谱体系,简化了分析过程。本文采用该法鉴定了黄连中小檗碱等5个化合物,黄精中6,8-二甲基-4’,5,7-三羟基高异黄烷酮等4个化合物。5、鉴于有些活性物质通过与细胞信号通路发生相互作用,本文建立了胰岛素抵抗3T3-L1细胞萃取-离线HPLC模型和胰岛素抵抗HepG2细胞萃取-离线UPLC模型。中药提取液与细胞共同孵育,得到细胞内容物,借助于UPLC、HPLC、HPLC-MS等色谱手段,分析活性物质。采用HepG2细胞萃取-离线UPLC法从黄连中分离得到小檗碱等5种生物碱;采用3T3-L1细胞萃取-离线HPLC法分离、鉴定结果:黄连中分离得到药根碱等5种化合物,黄精中分离得到6,8-二甲基-4’,5,7-三羟基高异黄烷酮等4种化合物,黄连黄精配伍组中分离得到小檗碱等8种化合物;在葡糖糖消耗实验显示了它们与模型组有显著性差异(P<0.05),结果表明这些物质可改善胰岛素抵抗。结论:本文所建立的3T3-L1脂肪细胞萃取色谱、HepG2细胞萃取色谱以及胰岛细胞膜磁性微球色谱等新型细胞膜色谱可用于中药药效物质的研究。通过上述方法对黄连、黄精及其二者配伍的初步研究表明黄连中含有的小檗碱等异喹啉型生物碱以及黄精中含有的高异黄酮类成分具有一定的改善胰岛素抵抗活性。因分离得到的化合物结构类型不同,作用于细胞的靶点可能不同,从而使得该配伍组合可起到一定的减毒增效的作用。本研究不仅为中药药效物质的研究提供了新思路,也为二者配伍提供了依据。