假单胞菌属(Pseudomonas)是假单胞菌科的一属,属于γ-变形菌纲,是分布最广的微生物之一。假单胞菌生存环境的多样性造就了假单胞菌多种多样的营养代谢类型,同时也为提供了丰富的遗传资源。随着基因组工程的发展,完成全基因组测序的假单胞菌种类越来越多,预测的次级代谢产物种类比较丰富,其中恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginoda),荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)和丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)是常见的几种假单胞菌,恶臭假单胞菌可以降解有机污染物,对环境进行生物修复,改造与有机污染物降解相关的基因是构建降解工程菌的基础;荧光假单胞菌是植物促生菌,可以在植物根部定植,产生对植物病原菌有拮抗作用的次生代谢产物;丁香假单胞菌是植物致病菌,染色体上的毒力岛基因簇中有致病因子的合成基因,通过对致病基因的改造可以更深入研究其致病机制;铜绿假单胞菌是人类的条件致病菌,其抗感染治疗面临严重的耐药性问题。减毒活疫苗是一种有效的铜绿假单胞菌感染治疗方法,减毒的铜绿假单胞菌需要通过基因工程方法改造获得。但是假单胞菌的几种模式菌株中还没有有效的遗传操作方法,本课题在Red/ET同源重组技术的基础上,根据假单胞菌自身噬菌体的重组蛋白构建一套新型高效简捷的遗传操作体系,并利用新型的遗传操作体系对假单胞菌基因组进行遗传修饰改造。以Red/ET同源重组技术为基础,构建一系列遗传操作系统。在假单胞菌和其噬菌体基因组中寻找大肠杆菌噬菌体λRed操纵子或者大肠杆菌Rac前噬菌体RecET操纵子类似的同源蛋白,BLAST显示铜绿假单胞菌噬菌体vB_PaeP_Tr60_Ab31 中有与 λRed 类似的操纵子(Orf38,Orf37 和 Orf36),来自 丁香假单胞菌 B728a 原噬菌体(Pseudomonas syringae pv.syringae B728a)中有与RecET类似的操纵子(RecTEpsy),分析显示Orf38类似于单链退火蛋白Redβ,Orf37类似于5’-3’的核酸外切酶Redα,Orf36类似于大肠杆菌DNA单链结合蛋白(SSB),以这两个操纵子为基础构建一系列的遗传操作系统。比较选择不同假单胞菌中最佳的遗传操作系统,利用最佳的遗传操作系统在不同假单胞菌中进行基因修饰。将构建的一系列遗传操作系统转入常见的假单胞菌恶臭假单胞菌、铜绿假单胞菌、荧光假单胞菌和丁香假单胞菌,比较这些遗传操作系统在不同假单胞菌的重组效率,确定不同菌最佳的遗传操作系统。功能检测结果表明,λRed类似的操纵子和RecET类似的操纵子与Redγ/Pluγ组成的杂合遗传操作系统能够在假单胞菌中工作,并且SSB蛋白可以显著的提高重组效率。通过比较与鉴定,分别挑选到了不同假单胞菌的最佳重组系统,成功对假单胞菌进行基因组的修饰,并与反向筛选标记共同作用对基因组进行无痕修饰,包括插入启动子和突变致病基因。在假单胞菌中建立和优化新型遗传操作系统,可方便、快捷地对假单胞菌进行遗传操作,构建的系统包括DNA双链核酸外切酶,DNA单链退火蛋白、宿主核酸外切酶抑制蛋白和宿主的单链结合蛋白。反应底物双链DNA可以通过一步PCR获得,进行遗传操作时一步重组得到需要的重组子,周期短效果明显,促进了假单胞菌和其他相关菌株的功能基因组学研究。铜绿假单胞菌噬菌体中的SSB蛋白能有效提高假单胞菌和大肠杆菌的重组效率。在研究假单胞菌的遗传操作系统时,发现来自于铜绿假单胞菌噬菌体的SSB蛋白在遗传操作系统中有比较重要的作用,在铜绿假单胞菌和大肠杆菌中,噬菌体vB_PaeP_Tr60_Ab31的SSB蛋白与Redy蛋白共表达可以提高遗传操作系统的重组效率。但是在本课题研究中SSB蛋白没有消除DNA双链二级结构的作用,还需要更进一步的研究来揭示SSB蛋白提高重组效率的机理。本课题是针对假单胞菌建立一系列新型、高效的遗传修饰系统。利用新型重组系统在假单胞菌中成功进行了一系列遗传修饰,包括进行点突变和与反向筛选标记结合的无痕修饰等。本课题构建的新型重组系统可以促进假单胞菌和其他相关菌株的功能基因组学研究。