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前列腺癌是男性泌尿系统最常见的恶性肿瘤,但目前缺乏敏感性和特异性俱佳的生物标志物,寻找一种理想的肿瘤生物标志物是当前前列腺癌临床和基础研究中备受关注的课题。Exosomes是细胞分泌到循环血液和体液中的一类包含特定蛋白质、m RNA和micro RNA(mi RNA)等信号分子的小囊泡。最新研究表明,mi RNA能够被主动选择性地包裹进Exosomes,并参与细胞间信息传递及通讯,其表达变化可以特异地反映机体某些生理病理状态的动态变化和转归,在肿瘤发生发展中有望成为良好的肿瘤特异性分子标志物,而且循环血液和体液中Exosomes的相关检测具备无创、简便等优点。因此,体液中的Exosomal mi RNA分子标志物在肿瘤临床诊断和预后评估等方面具有良好的应用前景。基于此,为了探讨Exosomal mi RNA在前列腺癌临床诊断中的作用,我们进行了以下三部分研究:第一部分前列腺癌血清Exosomes的分离、鉴定及其生物学特性目的:建立稳定的血清Exosomes分离方法并进行形态学和分子表型鉴定,探讨前列腺癌Exosomes的生物学特性。方法:采用Exo Quick沉淀试剂分离血清Exosomes,用透射电镜和Nano Sight分析仪,以及Western blot和流式细胞术分别进行形态学和分子表型鉴定。将来自前列腺癌患者混合血清的Exosomes与正常基质细胞WPMY-1共培养,用激光共聚焦显微镜观察前列腺癌Exosomes在受体细胞中的转运;分别采用CCK-8法、Transwell侵袭实验和划痕实验检测前列腺癌血清Exosomes对WPMY-1细胞增殖、侵袭和迁移能力的影响。结果:1、血清Exosomes的提取和鉴定:采用Exo Quick从人血清中分离到的沉淀物,颗粒直径约为30~100nm,最大分布峰值为58nm,能够表达特征性蛋白HSP70和CD63,符合Exosomes的主要特征。2、前列腺癌血清Exosomes的生物学特性:经过24h共培养,激光共聚焦显微镜观察到前列腺癌血清Exosomes能够穿过细胞膜转运到受体细胞中,且转运量与Exosomes的初始浓度相关;前列腺癌血清Exosomes可以使正常前列腺基质细胞WPMY-1的增殖能力显著提高,且与作用时间和Exosomes的作用浓度成正比;此外,前列腺癌Exosomes能够促使正常基质细胞的侵袭能力和迁移能力显著增强。结论:采用Exo Quick沉淀试剂从血清中可以稳定分离出Exosomes,前列腺癌血清Exosomes能促使正常基质细胞表现出显著的增殖、侵袭和迁移能力,提示其可能与肿瘤的发生发展关系密切,很有必要进一步探讨其在肿瘤临床诊疗中的价值。第二部分Exosomal mi RNA检测在前列腺癌诊断中的价值目的:研究Exosomes在前列腺癌循环mi RNA检测中的价值。方法:采用Exo Quick沉淀试剂分离Exosomes,提取RNA,并用Agilent 2200生物分析仪进行质量分析。采用q RT-PCR法检测mi RNA的相对表达量。结果:1、Exosomal RNA的分布及其特点:Agilent 2200生物分析仪检测结果提示血清Exosomes中富含小RNA。10例健康人群血清Exosomes中均可检出4种常见mi RNA(mi R-21,mi R-16,mi R-20a和let-7a),且其相对表达量显著高于全血清样本和去除Exosome后的上清液。2、Exosomes在前列腺癌血清循环mi RNA检测中的价值:血清Exosomes中的mi R-141表达水平显著高于血清游离mi R-141,且二者显著相关,PCa组的Exosomal mi R-141含量显著高于BPH组和正常对照人群;q RT-PCR检测51例PCa患者和40例正常对照人群的血清Exosomal mi R-141表达水平,结果表明PCa组的Exosomal mi R-141表达水平显著高于正常对照组(P<0.0001),且与肿瘤临床病理特征有不同程度的相关性。采用Exosomal mi R-141判断转移性前列腺癌的ROC曲线下面积(AUC)为0.8694,检测敏感性和特异性分别为80%和87.10%。3、前列腺癌患者尿液Exosomal mi RNA的初步检测:在血清学研究的基础上,我们对10例前列腺癌患者的尿液样本进行了探索性研究。结果显示,所有患者尿液Exosomes样本中均可不同程度地检出mi R-141,但总体表达水平与对照组之间未见显著性差异(P=0.0992)。结论:分离血清Exosomes有利于提高某些循环mi RNA的检测敏感性,尿液Exosomes中也可以检测到mi RNA,这就为前列腺癌Exosomal mi RNA标志物的研究提供了新的思路和可能性。第三部分前列腺癌尿液Exosomal mi RNA差异表达谱的测序筛选目的:测序筛选前列腺癌患者尿液Exosomal mi RNA差异表达谱。方法:选取转移性前列腺癌、局限性前列腺癌和健康男性各3例,留取晨尿。采用Exo Quick-TC沉淀试剂分离尿液Exosomes,提取RNA并采用Agilent 2200生物分析仪进行质检,构建c DNA文库,采用Illumina Hi SeqTM 2500平台进行小RNA序列测定。将测序数据与mi RBase21.0数据库进行比对,计算各样本的mi RNA表达量并进行组间差异分析,筛选出前列腺癌的尿液Exosomal mi RNA差异表达谱。对存在显著性差异的基因进行q RT-PCR初步验证。结果:经过深度测序,尿液Exosomes中mi RNA的平均含量为(8.10±0.03)%,各样本间未见显著差异。通过组间比对,发现Exosomal mi R-375差异最为显著,在正常对照、局限癌和转移癌组中呈渐进性低表达,采用20例前列腺癌尿液样本对其进行q RT-PCR初步验证,所得结果与测序一致。此外,另有22个mi RNA在前列腺癌中出现差异表达,其中10个呈渐进性低表达(mi R-664a-5p,mi R-200b-5p,mi R-30a-5p,mi R-30a-3p,mi R-200c-3p,mi R-151a-3p,mi R-532-5p,mi R-361-3p,mi R-30d-5p,mi R-148-3p),12个呈渐进性高表达(mi R-126-5p,mi R-3656,mi R-199a-5p,mi R-4508,mi R-9-5p,mi R-1-3p,mi R-126-3p,mi R-199a-3p,mi R-4497,mi R-1273g-3p,mi R-4532,mi R-3960)。结论:通过深度测序,初步筛选出包括mi R-375在内的23个差异表达基因,为进一步验证和研究前列腺癌尿液Exosomal mi RNA表达谱奠定了基础。