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目的:表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKIs)是EGFR突变阳性晚期非小细胞肺癌首选治疗方案,但是大部分患者在经过第一代EGFR-TKIs治疗约10个月后出现获得性耐药,EGFR T790M二次突变是获得性耐药的主要机制之一。针对T790M突变的第三代EGFR-TKI奥希替尼己被用于临床,并取得了良好的疗效。然而使用奥希替尼约在10个月后仍无法避免的出现了获得性耐药,最终导致肿瘤进展。目前,由于对奥希替尼获得性耐药机制尚不完全清楚,化疗是第三代EGFR-TKI耐药后NSCLC的主要治疗手段,如何选择有效的化疗药物克服奥希替尼获得性耐药是临床面临的主要问题之一,遗憾的是目前缺乏基础和临床研究。本研究中,我们选择EGFR 19外显子缺失突变和20外显子T790M突变的吉非替尼获得性耐药细胞株PC-9/ZD,用奥希替尼诱导并建立了第三代EGFR-TKI奥希替尼的继发耐药细胞模型,探索奥希替尼可能的耐药机制和奥希替尼获得性耐药后对不同的化疗药物敏感性。方法:1)采用体外倍增浓度法,对吉非替尼获得性耐药细胞株PC-9/ZD,逐步递增奥希替尼浓度,历时7个月,成功建立奥希替尼获得性耐药细胞株PC-9/ZDOR。2)CCK-8法检测亲本细胞PC-9/ZD对吉非替尼、奥希替尼敏感性;耐药细胞株PC-9/ZDOR对吉非替尼、奥希替尼敏感性、化疗药物敏感性,并检测不同抑制剂联合奥希替尼的逆转耐药作用。3)NGS技术检测PC-9/ZD及PC-9/ZDOR基因突变情况。4)Western blot法检测细胞耐药前后EGFR及其相关蛋白表达情况。5)绘制生长曲线、流式细胞术检测细胞增殖情况。结果:1.本研究选用NSCLC吉非替尼获得性耐药细胞株PC-9/ZD,行NGS检测结果为EGFR 19 del伴20外显子T790M突变,CCK-8法结果显示该细胞株对吉非替尼耐药指数(RI)为11.74,结果表明PC-9/ZD为吉非替尼耐药细胞株。2.予以逐步递增奥希替尼剂量法建立奥希替尼获得性耐药细胞株PC-9/ZDOR,历时7个月,并在洗脱奥希替尼3个月后,行CCK-8法测得奥希替尼对PC-9/ZD及PC-9/ZDOR 的半数抑制浓度(IC50)分别为(0.08±0.16)和(3.522±0.038)μ mol/L,RI为44,说明PC-9/ZDOR对奥希替尼耐药细胞。3.耐药细胞株PC-9/ZDOR不仅对奥希替尼耐药,并仍然保持对一代TKI吉非替尼耐药,相较于PC-9/ZD对吉非替尼的IC50值(5.12±0.364)μ mol/L,耐药细胞株PC-9/ZDOR对吉非替尼表现出更高耐药性,其IC50为(9.645±0.629)μ mol/L。4.对比亲本细胞PC-9/ZD,NGS检测耐药细胞株PC-9/ZDOR结果显示为EGFR 19del突变及T790M突变均消失,未见C797S及其他EGFR基因突变,但伴有其他31个新发点突变,如 MET c.2584-13 2584-9ddel、FGFR p.A343V、KRAS p.G13D、ERBB3 p.Q261 等。5.采用Western blot的方法,显示与PC-9/ZD细胞相比,PC-9/ZDOR细胞株EGFR及其磷酸化蛋白表达呈显著减少(P<0.05);E-Cadherin和N-Cadherin的蛋白表达量明显减少(P<0.05),间质标志Vimentin的蛋白表达量未见增加(P>0.05),表明耐药细胞株未发生EMT。6.选取31个新发突变点中丰度大于45%,且与EGFR-TKI耐药机制相关的突变点ERBB3、FGFR1、KRAS、MET,行不同小分子抑制剂联合奥希替尼作用PC-9/ZDOR,其中MET 抑制剂 crizotinib 组、FGFR1 抑制剂 PD173074 组、Erbb3 抑制剂 sapitinib 组IC50值未降低(P<0.05),表明未能逆转耐药。虽然MEK1/2抑制剂selumetinib组的IC50值稍降低(P>0.05),进一步行Chou-Talalay疗效分析法对两药的联合效应进行评价后发现selumetinib联合奥希替尼,低于10 μ mol/L浓度组的联合指数(CI)均超过临界值1,表明为拮抗效应,表明也未能逆转耐药。7.PC-9/ZDOR细胞株对化疗药物多西他赛、吉西他滨和紫杉醇敏感性优于培美曲塞和顺铂(P<0.05),且对多西他赛、吉西他滨和紫杉醇的敏感性明显高于亲本细胞(P<0.05)。结论:1.我们通过浓度递增法成功获得奥希替尼获得性耐药细胞株PC-9/ZDOR,其中EGFR基因突变丢失和EGFR及其磷酸化蛋白表达显著减少。EGFR靶点丢失可能是奥希替尼耐药机制之一。2.奥希替尼获得性耐药后新发突变点抑制剂crizotinib、PD173074、sapitinib、selumetinib联合奥希替尼作用耐药细胞株未能逆转耐药。3.耐药后细胞株对紫杉类、吉西他滨化疗药物敏感性优于培美曲塞、顺铂。