论文部分内容阅读
核袭击、大型核事故等可造成众多人员受到大剂量射线照射。急性放射病（或称为急性放射综合症,ARS）是机体在短时间内受到大剂量（>1Gy）电离辐射引起的造血、胃肠等多组织器官损伤的全身性疾病。根据照射剂量大小、病理和临床过程等特点,把ARS分为骨髓型、肠型和脑型,其中骨髓型又分为轻、中、重和极重四度。造血组织中的造血干细胞、祖细胞具有很高的放射敏感性,受射线作用后很快就有明显的损伤,导致全血细胞减少。粒细胞集落刺激因子（G-CSF）是造血因子的一种,能特异刺激粒系祖细胞增殖、分化,并维持其功能与存活。1991年美国FDA批准重组人G-CSF（rh G-CSF）上市,主要用于预防和治疗肿瘤放疗或化疗后引起的粒细胞减少症、骨髓造血机能障碍性疾病等。大量研究表明,rh G-CSF照后给药可显著促进大剂量照射小鼠和猕猴的外周血白细胞恢复,提高致死性照射动物的存活率。rh G-CSF是目前辐射事故病人临床治疗中的首选药物。2018年美国FDA批准rh G-CSF治疗急性放射病的新适应症。rh G-CSF多为大肠杆菌或CHO细胞表达,体内给药半衰期短,并有皮疹、潮红、骨疼等副作用。因此,应用小分子化合物促进内源性G-CSF生成倍受国内外学者的关注。维生素E早在20世纪20年代就被人们发现,包括生育酚和生育三烯酚两类共8种化合物,即α、β、γ和δ构型的生育酚和生育三烯酚。维生素E除能促进生殖外,还具有多种生物学作用,如抗氧化、抑制脂质过氧化性、降低胆固醇合成、抗癌等作用。近年来研究发现γ-和δ-生育三烯酚以及生育酚琥珀酸酯衍生物具有较强的抗放活性和诱导内源性G-CSF生成作用,照前给药可显著提高致死性照射小鼠的存活率,且发现该类化合物的抗放活性依赖于内源性G-CSF生成。相较于生育酚,生育三烯酚具有更强的促G-CSF生成作用。生育三烯酚是棕榈油和米糠油的一种功能性成分,但含量少,种类多,分离困难。δ-生育三烯酚（DT3）在胭脂果油中含量丰富,种类单一,易于获得。基此,本研究拟应用ELISA、造血干、祖细胞表面标志分析、骨髓造血细胞竞争移植实验等多种方法,探讨了DT3诱导小鼠体内G-CSF生成的剂量-时间效应,比较DT3升高G-CSF的作用专一性,了解DT3对健康小鼠外周血细胞生成、骨髓造血以及脾脏髓外造血的影响,并研究了DT3对急性放射病小鼠的治疗作用及其机制。1. DT3剂量和时间依赖地诱导小鼠内源性G-CSF生成研究发现DT3 100 mg kg-1可显著促进小鼠体内G-CSF生成,单次给药后48 h内以及连续给药期间小鼠血清G-CSF浓度均可维持在较高水平。发现DT3对小鼠CXCL1生成也有一定的升高作用,给药期间小鼠血清TPO和EPO略有升高。DT3可显著增加小鼠淋巴-造血组织如胸腺、脾、淋巴结和骨髓组织的G-CSF含量,而对其它组织器官G-CSF生成则没有明显影响。2. DT3促进小鼠骨髓造血干祖细胞增殖以及外周血白细胞和血小板生成DT3连续给药5 d可显著促进健康小鼠外周血白细胞、中性粒细胞和单核细胞的动员和生成,给药期间和给药后外周血血小板有轻微升高,而淋巴细胞和红细胞则有一过性降低。DT3给药后28 d内骨髓有核细胞同对照组没有显著增加,但骨髓造血干祖细胞（LSK）比例和绝对数于开始给药后3至28 d内明显高于对照组,长期造血干细胞的比例和数量在给药后早期增加显著,而短期造血干细胞的比例和数量则在给药后期增加明显。3. DT3动员小鼠骨髓造血干细胞,增强脾脏髓外造血脾脏髓外造血可反映骨髓造血的活跃程度。研究发现DT3开始给药后第3 d脾脏重量开始增加,脾指数升高,均于第14 d达峰值,随后开始降低,第28 d已接近正常水平。伴随脾脏指数的升高,脾脏造血干细胞（LSK）和祖细胞（LK）比例和数量也明显增加,均于第10 d达峰值,随后开始降低,第28 d已接近正常水平。给药期间及给药后28 d内,长期造血干细胞、短期造血干细胞以及多能祖细胞比例和数量均明显高于对照组,达峰时间分别位于给药后第10、14和21 d。脾脏有核细胞数在给药后14和21 d也明显高于对照组。应用造血细胞竞争移植实验分析了给药后第10 d骨髓和脾脏造血干细胞的重建能力,发现DT3给药后骨髓造血细胞的重建能力较对照组明显降低,而脾脏造血细胞的重建能力则显著高于对照组,说明DT3动员了骨髓造血干细胞进入到脾脏,进而增强了脾脏髓外造血。4. DT3照后给药可促进亚致死照射小鼠骨髓造血功能重建以及外周血细胞的恢复在7Gy照射小鼠模型上,研究了DT3治疗骨髓型急性放射病的最佳时程和剂量效应。发现DT3 100 mg kg-1,照后2 h开始给药,连续给药5 d,对照射小鼠外周血白细胞、红细胞和血小板恢复的效果最忧;增加DT3剂量至200 mg kg-1时,其促造血恢复效果没有进一步增强。于照后第10 d分别检测照射小鼠骨髓造血干细胞数量和功能,发现DT3给药组骨髓有核细胞数、造血干细胞（LSK）和造血祖细胞（LK）比例和数量明显高于对照组,其中长期造血干细胞和多能祖细胞的比例和数量也明显高于照射对照组。造血细胞竞争移植实验发现DT3给药组小鼠骨髓细胞的造血重建能力也明显高于对照组。综上所述,DT3可剂量和时间依赖地诱导小鼠内源性G-CSF生成。DT3短时程给药可增加健康小鼠骨髓造血干、祖细胞数量,促进外周血白细胞和血小板生成,动员骨髓造血干细胞进入到脾脏,进而增强了脾脏的髓外造血。并发现DT3照后短时程给药可促进亚致死照射小鼠骨髓造血功能的重建以及外周血细胞的恢复。DT3副作用小,易于获得,在急性放射病的治疗中具有潜在的应用前景。