茯苓羊毛甾醇合酶基因PcLSS克隆及其功能验证

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通常说的茯苓(Poriacocos(Schw.)Wolf)除了药用之外也可作为食用,可以与非常多的药材配伍,属于多孔菌科(Polyporaceae)的一种高等真菌。其主要功能成分为三萜和多糖类物质,具有驱风除湿、增强抵抗力、抗肿瘤、抗炎、安魂养神等多种药理功能。在生成胆甾醇类物质的过程中,四环三萜类化合物羊毛甾醇是其中间体,由羊毛甾醇合酶(LSS)催化生成。该酶是一个很重要的酶。在真菌与植物的三萜类物质代谢途径中,它们有共同的上游物质基础,而在茯苓中关于羊毛甾醇合酶的生物功能尚无详细报到,本文正是利用这一点来验证该生物合成酶的功能。采用分子生物学相关方法克隆出了茯苓中羊毛甾醇合酶基因(PcLSS)。通过羊毛甾醇合酶基因突变型酿酒酵母菌株异源互补系统验证其基因功能。通过冷休克表达系统研究了该酶蛋白表达及纯化条件,同时研究了基因在不同生长天数的表达特性。主要研究结果如下:1成功克隆PcLSS基因利用分子生物学相关方法获得PcLSS基因CDS区 2187 bp(GeneBanK No:KR336544),gDNA5408 bp(GeneBanK No:KR336543)。启动子区含有与脱落酸、光、茉莉酸甲酯等多种与转录调控相关的转录顺式元件。PLSS由728个氨基酸组成分子量大小为83.4 kDa的不稳定亲水性蛋白。通过分析PcLSS蛋白序列发现其与丝孔菌属蛋白序列相似度较高,NJ进化树结果表明其物种所处的分类地位与蛋白的聚类结果相符合。2 PSS基因能互补酵母ERG7基因功能利用传统双酶切再连接的方法获得pYES2-pclss质粒,转化至ERG7杂合二倍体酿酒酵母突变菌株YHR072W中。在四分体时期挑选出含目的基因的缺陷型单倍体菌株,将两种缺陷型菌株划线于YPG和YPG+麦角甾醇(ergosterol)培养基上,进行表型分析,得到的展示结果符合菌株的生长特性,证明获得的PcLSS基因在酿酒酵母中介导了麦角甾醇的生成,有LSS基因功能。3蛋白表达以及纯化用双酶切的方法构建原核表达所须的pColdI-pcLSS重组质粒,并将其转化至E.coli菌株BL21(pG-KJE8)中进行冷休克表达(15℃),试验不同的蛋白表达条件,将最优表达条件下获得的目的蛋白过HIS纯化柱纯化进而得到PcLSS蛋白。4 PcLSS基因在菌丝生长到12天时,基因表达量达到最高利用qRT-PCR的方法比较了在28℃条件下菌丝生长到6、9、12、15、18天时基因的相对表达量,以CYP基因作为内参基因,结果显示当菌丝生长到第12天时,基因表达量达到最高。如前所述,本试验通过分子生物学方法克隆出PcLSS基因,通过缺陷型单倍体酵母异源功能互补方法验证其功能。通过相关在线基因分析工具和手段分析了 PcLSS基因及蛋白的相关理化性质及调控位点。通过冷刺激处理获得了目的蛋白PcLSS并将其纯化。实时荧光定量PCR结果显示在菌丝生长至12天时,PcLSS基因相对表达量达到最高。
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