论文部分内容阅读
梅克尔软骨是来源于第一腮弓的透明软骨,为下颌骨早期发育提供机械支撑(mechanical support),在出生后不久便退化消失。在梅克尔软骨的退化过程中,细胞外基质降解、软骨细胞死亡,但其机制尚不明确。NELL1主要表达于神经嵴来源的颅面部组织中,参与调控软骨细胞的增殖与分化,其具体作用和机制存有较大争议。本研究通过检测NELL1及相关因子在梅克尔软骨退化过程中的表达变化,并构建腺病毒介导的NELL1过表达载体转染软骨细胞,探讨NELL1是否参与梅克尔软骨退化及其对软骨细胞的作用；通过检测自噬和凋亡相关因子在梅克尔软骨退化过程中的表达变化,研究梅克尔软骨细胞死亡的可能机制。第一部分NELL1在梅克尔软骨退化过程中的表达及意义NELL1在颅面部骨发育中发挥重要作用,参与调控软骨细胞的增殖和分化,该基因在梅克尔软骨退化过程中的表达及作用尚未见文献报道。目的：通过检测NELL1及相关因子在梅克尔软骨退化过程中的表达变化,探讨NELL1在此过程中的作用及机制。方法：利用E15.5、E16.5、E17.5的小鼠,应用阿尔新蓝-茜素红染色、甲苯胺兰染色检测梅克尔软骨退化过程中的组织学变化,应用免疫组化或Realtime PCR检测Col2、Col10、BMP2、RUNX2、NELL1、NFATc1、ERK、 MMP9、MMP13等在梅克尔软骨中的表达。结果：阿尔新蓝-茜素红染色和甲苯胺兰染色显示,在E15.5时梅克尔软骨呈长柱状,由成熟的软骨细胞组成,细胞外基质未见明显降解；在E16.5时梅克尔软骨中份软骨细胞肥大化,部分细胞外基质降解；在E17.5时细胞外基质降解明显,软骨细胞死亡消失,梅克尔软骨中份不连续。免疫组化显示BMP2、NELL1、NFATc1、ERK、MMP9从E16.5开始表达于肥大软骨细胞,Realtime PCR显示从E15.5到17.5过程中,Col2表达下降,Co110、NELL1、NFATc1、MMP9、MMP13表达上升,ERK未见明显变化。结论：梅克尔软骨中份自E16.5开始降解退化,NELL1可能通过NFATc1或ERK信号通路调控MMP9、MMP13的表达,促进梅克尔软骨细胞外基质的降解。第二部分腺病毒介导的NELL1过表达载体转染对软骨细胞的作用NELL1对软骨细胞的具体作用存有较大的争议。本研究第一部分发现NELL1表达于梅克尔软骨退化过程中的肥大软骨细胞,其具体作用及机制尚不明确。目的：通过构建腺病毒介导的NELL1过表达载体转染软骨细胞,检测软骨细胞相关指标的变化,探讨NELL1对软骨细胞的具体作用及机制。方法：构建腺病毒介导的NELL1过表达载体,转染原代培养的肋软骨细胞,Western blotting或Realtime PCR检测NFATc1、ERK、MMPs和TIMPs的表达变化。结果：成功构建腺病毒介导的NELL1过表达载体。将该腺病毒载体转染软骨细胞后,NFATc1、ERK、MMP9、MMP13等表达明显升高,并与NELL1的转染量存在剂量效应关系。TIMP3和TIMP4表达量明显下降。Western blotting检测显示MMP9、ERK的表达量升高,并与NELL1的转染量存在剂量效应关系。结论：NELL1通过上调NFATc1或ERK,促进MMPs的表达,参与软骨细胞外基质的降解。第三部分自噬在梅克尔软骨退化过程中的作用梅克尔软骨退化与软骨内成骨的分子机制不尽相同,但组织学表现极为相似,如软骨细胞肥大化、细胞外基质降解、随后软骨细胞逐渐死亡消失。自噬参与软骨内成骨终末分化的软骨细胞死亡,其是否参与梅克尔软骨退化过程中软骨细胞死亡尚未见研究。目的：通过检测自噬和凋亡相关因子在梅克尔软骨退化过程中的表达变化,探讨自噬、凋亡在软骨细胞死亡过程中的作用及关系。方法：利用E15.5、E16.5、E17.5的小鼠,应用免疫组化或Realtime PCR检测梅克尔软骨中份Belcin1、LC3、Caspase3、Bcl2的表达,应用TUNEL检测梅克尔软骨中份DNA片段化。结果：免疫组化显示Beclin1和LC3主要表达于肥大软骨细胞和终末分化的肥大软骨细胞,Realtime PCR检测显示Beclin1和LC3的表达量从E15.5至E17.5逐渐升高。TUNEL和Caspase3阳性信号未见于梅克尔软骨细胞,主要表达于终末分化的肥大软骨细胞外侧；同时Realtime PCR显示Bc12的表达量从E15.5至E17.5明显增强。结论：在梅克尔软骨退化过程中,自噬发生在肥大软骨细胞中,可能参与软骨细胞死亡,而凋亡并不参与软骨细胞的死亡。