前言肾间质纤维化是一个非特异的病理过程,是慢性肾脏疾病(chronic kidney disease,CKD)病情进展的共同最后通路。阻止肾间质纤维化是阻止CKD进展的有效途径,而CKD尤其是进展到终末期肾病阶段病人的巨大花费,成为重要的社会经济问题,深入了解肾间质纤维化的机制以及寻找新的治疗靶点是国内外学者持续研究的热点。PAX2(Paired Box2)基因编码的蛋白是一种DNA结合蛋白,是维持胚胎期肾脏正常发育的重要调控因子,胚胎期PAX2基因的缺失、突变或过表达等异常,会导致肾-视神经盘缺损综合征、肾发育不全、膀胱输尿管返流、多囊肾等一系列肾脏疾病。肾脏发育成熟后,PAX2蛋白的表达量迅速下降,而在急性肾损伤及慢性肾脏疾病等病理情况下,PAX2出现表达增高。揭示发育基因PAX2在成熟肾脏的病理情况下异常表达机制及作用靶点,将为肾脏疾病的治疗提供新的途径。单侧输尿管梗阻(unilateral ureteral obstruction,UUO)鼠模型是研究CKD及肾间质纤维化常用的动物模型。研究显示,在UUO鼠肾脏,发育基因PAX2在肾小管上皮细胞内出现再表达,PAX2表达量与梗阻时间成正相关,证明PAX2参与了肾间质纤维化的病理过程。体外实验研究结果显示,PAX2参与促进上皮-间充质细胞转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT),而EMT是促进肾间质纤维化重要的病理现象,提示PAX2可能通过促进EMT而加重肾间质纤维化。但PAX2参与肾间质纤维化的具体机制仍不明确。本研究首先以过表达PAX2基因的大鼠肾小管细胞(NRK-52E)模型为对象,通过基因芯片筛选PAX2基因的下游差异mRNA表达,得到差异基因表达谱。再通过生物信息学方法,进行信号通路分析,结合文献查阅,确定需要进一步验证的兴趣基因,通过Real time PCR、Western-blot在细胞学水平进行验证,最后通过Western-blot、免疫组织化学等方法在UUO模型大鼠肾脏对兴趣基因的表达进行验证,旨在探寻PAX2下游基因在肾间质纤维化的作用,探索治疗肾间质纤维化新的生物学靶点。材料和方法一、实验对象1、采用大鼠肾小管细胞系(NRK-52E)为实验对象(中国科学院细胞库),利用慢病毒为载体(上海吉凯基因公司),携带大鼠PAX2基因,通过慢病毒转染的方式,使NRK-52E过表达PAX2基因,以空载慢病毒转染NRK-52E为对照组。以转染后72h的实验组及对照组细胞为研究对象进行芯片筛查检测。2、选取SPF级雄性4周龄Wistar大鼠(体重50-100g)24只(中国医科大学附属盛京医院实验动物中心提供),随机分为4组,每组6只,假手术组作为对照组,再按UUO术后时间分为3d、7d和14d组。标准饲料喂养。二、实验方法(一)PAX2基因诱导NRK52E细胞上皮-间充质转化模型的建立采用慢病毒携带PAX2基因(LV-PAX2)及空载病毒(LV-con)转染NRK-52E细胞,传代培养,通过倒置显微镜观察转染后细胞状态及形态改变,通过荧光显微镜观察转染情况并计算转染率,通过Real-time PCR及Western-Blot检测PAX2基因及EMT相关指标表达变化,通过细胞划痕实验检测细胞迁移功能的变化,发现转染后72h为最佳时间点,证实过表达PAX2基因使NRK-52E细胞出现EMT现象。(二)过表达PAX2基因的NRK-52E细胞系的差异mRNA表达谱的筛选选用转染LV-PAX2后72h细胞组为实验组,转染LV-con细胞组为对照组,以6孔板的1个孔的细胞量(约1×10~6)为1个样本,提取2组各提取3个样本的总mRNA,检测合格后与表达谱芯片Rat OneArray Plus进行杂交反应,芯片版本ROA1.1,芯片结果采用Agilent 0.1 XDR扫描分析,对芯片发现的差异性表达mRNA,进一步进行Gene Ontology分析和KEGG通路分析,经文献检索,选取与肾间质纤维化有关的补体通路相关差异基因进行下一步验证实验。(三)补体相关差异基因在细胞学水平及UUO大鼠肾脏水平的验证1、细胞学水平验证以表达谱芯片研究结果为基础,结合文献检索,选择补体通路为进一步验证的候选信号通路,包括Complement3(C3)、CD55、CFH、SERPING1、C1S,通过Real time PCR、Western blot对以上指标进行细胞学水平的验证。2、UUO大鼠肾脏水平的验证建立大鼠UUO模型,观察术后3d、7d和14d肾脏大体形态改变。通过Masson染色检测肾间质纤维化程度,通过免疫组织化学染色及Western blot方法,验证补体系统相关差异基因的表达。三、统计学分析结果通过SPSS17.0统计软件进行处理,采用均数独立样本T检验,P<0.05为有统计学差异,两变量相关分析采用Pearson相关分析,P<0.05有统计学意义。结果一、PAX2基因诱导NRK52E细胞上皮-间充质转化模型的建立1、成功构建过表达PAX2基因的慢病毒载体(LV-PAX2)并转染至NRK52E细胞,通过荧光显微镜观察转染后48h开始出现绿色荧光表达,并持续至72h、96h,转染率>80%。2、LV-PAX2转染NRK-52E细胞后48h开始逐渐出现由圆形或椭圆形的上皮细胞形态向梭形或针尖形间充质细胞形态转变。3、通过Real-time PCR及Western Blot证实LV-PAX2转染NRK-52E细胞后72h为PAX2蛋白表达量最高的时间点(n=3,P<0.05)。4、通过Western Blot检测EMT指标,证实过表达PAX2基因使α-SMA上调,E-cadherin表达下调(n=3,P<0.05)。5、通过细胞划痕实验,证实过表达PAX2基因使NRK-52E细胞迁移率增加(n=3,P<0.05)二、过表达PAX2基因的NRK-52E细胞系的差异mRNA表达谱的筛选1、通过表达谱芯片Rat OneArray Plus对过表达PAX2基因的NRK-52E细胞和转染空载慢病毒的NRK-52E细胞在转染后72h进行了高通量差异mRNA的筛选检测,差异mRNA表达入选标准为log2 ratio>=1.0或<=-1.0并且P<0.05,共筛选出上调基因298个,下调基因293个。2、通过KEGG通路分析,得出PAX2基因诱导NRK-52E细胞出现上皮间充质细胞转化后的下游差异基因表达涉及细胞因子及受体、细胞外基质及受体、MAPK、局部粘附、癌症、补体及凝结系列等信号通路。3、通过GO分析,得出PAX2基因诱导NRK-52E细胞出现上皮间充质细胞转化后的下游差异基因表达涉及水解酶活性、高磷酯水解酶活性、细胞外基质成份等分子功能,细胞发育、信号转导、系统发育等生物学过程,细胞浆、细胞膜、细胞外基质等细胞成分系列。4、通过文献检索,选取与肾间质纤维化及细胞EMT相关的通路,最终选择补体通路为候选验证系列,所涉及的补体通路的差异基因包括C3、CD55、CFH、C1S及SERPING1。C3上调,CD55、CFH、C1S及SERPING1下调(n=3,P<0.05)。三、补体相关差异基因在细胞学水平及UUO大鼠肾脏水平的验证(一)补体相关差异基因在细胞学水平的验证1、通过Real time PCR验证补体系统相关差异基因的mRNA表达,结果显示:C3mRNA上调1.9倍(n=3,P<0.05),CD55mRNA下调0.17(n=3,P<0.05),CFHmRNA下调0.5(n=3,P<0.05)。以上结果与高通量mRNA芯片结果变化趋势一致。C1S及SERPING1结果无统计学差异。2、通过Western-blot验证补体系统相关差异基因的蛋白表达,结果显示:C3表达上调,CD55、CFH下调(n=3,P<0.05),与Real time PCR及芯片的结果一致。(二)补体相关差异基因UUO大体水平的验证1、肾脏大体显示UUO术后肾盂扩张,肾皮质变薄;通过Masson染色及肾间质纤维化指数计算,分析UUO术后大鼠肾脏纤维化情况,结果显示UUO术后3d,7d,14d,肾间质纤维化指数均高于sham组,随着梗阻时间的延长,肾间质纤维化加重(n=6,P<0.05)。2、通过Western-blot检测UUO大鼠肾脏EMT指标变化,结果显示α-SMA蛋白在UUO组表达均高于sham组(n=6,P<0.05);α-SMA表达随梗阻时间延长表达量逐渐增加;通过Pearson相关性分析,计算α-SMA蛋白表达量与PAX2蛋白表达量的关系,结果表明α-SMA表达量与PAX2蛋白表达量呈正相关(n=6,r=0.985,P<0.05)。E-cadherin蛋白在UUO组表达均低于sham组(n=6,P<0.05);E-cadherin表达随梗阻时间延长表达量逐渐减少;通过Pearson相关性分析,计算E-cadherin蛋白表达量与PAX2蛋白表达量的关系,结果表明E-cadherin表达量与PAX2蛋白表达量呈负相关(n=6,r=—0.981,P<0.05)。3、通过Western-blot检测UUO大鼠肾脏PAX2蛋白表达情况,结果显示PAX2蛋白在UUO组表达均高于sham组(n=6,P<0.05);PAX2蛋白随梗阻时间延长表达量逐渐增加;通过Pearson相关性分析,计算PAX2蛋白表达量与肾间质纤维化指数的关系,结果表明PAX2蛋白与肾间质纤维化程度呈正相关(n=6,r=0.983,P<0.05)。4、通过免疫组织化学染色,检测PAX2、C3、CFH、CD55在UUO组大鼠及sham组大鼠的表达情况,结果显示PAX2在sham组大鼠肾脏皮质区域未见阳性表达,在UUO大鼠肾脏皮质,PAX2主要表达在扩张的肾小管细胞核内;C3在sham组大鼠肾脏未见阳性表达,在UUO大鼠肾脏,C3表达主要在扩张的肾小管细胞质内;CFH、CD55在sham组大鼠肾小管细胞质内呈阳性表达,在UUO术后大鼠的扩张的肾小管细胞质表达下降。5、通过Western-blot检测UUO大鼠肾脏C3蛋白表达情况,结果显示C3蛋白在UUO组表达均高于sham组(n=6,P<0.05);C3表达随梗阻时间延长表达量逐渐增加;通过Pearson相关性分析,计算C3蛋白表达量与PAX2蛋白表达量的关系,结果表明C3表达量与PAX2蛋白表达量呈正相关(n=6,r=0.985,P<0.05)。6、通过Western-blot检测UUO大鼠肾脏CFH蛋白表达情况,结果显示CFH蛋白在UUO组表达均低于sham组(n=6,P<0.05);CFH表达随梗阻时间延长表达量逐渐减少;通过Pearson相关性分析,计算CFH蛋白表达量与PAX2蛋白表达量的关系,结果表明CFH表达量与PAX2蛋白表达量呈负相关(n=6,r=—0.985,P<0.05)。7、通过Western-blot检测UUO大鼠肾脏CD55蛋白表达情况,结果显示CD55蛋白在UUO组表达均低于sham组(n=6,P<0.05);CD55表达随梗阻时间延长表达量逐渐减少;通过Pearson相关性分析,计算CD55蛋白表达量与PAX2蛋白表达量的关系,结果表明CD55表达量与PAX2蛋白表达量呈负相关(n=6,r=—0.991,P<0.05)。结论1、通过以慢病毒为载体携带PAX2基因转染NRK-52E细胞,诱导其出现EMT现象,并发现转染后72h为最佳时间点,成功建立PAX2基因体外诱导EMT细胞模型。2、以慢病毒为载体携带PAX2基因转染NRK-52E细胞,发现上调基因298个,下调基因293个,涉及细胞因子及受体、细胞外基质及受体、MAPK、局部粘附、癌症、补体及凝结系列等信号通路。其中补体通路与肾间质纤维化关系密切(C3上调,CD55、CFH、C1S及SERPING1下调),故选为候选兴趣基因系列。3、在细胞学水平证实补体C3上调,CD55及CFH下调,生物信息学预测PAX2基因很可能为C3、CD55及CFH的上位基因。在UUO大鼠肾脏,证实随着梗阻时间的延长,替代补体途径相关基因C3上调,CD55、CFH下调。