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Y染色体在动物性别决定和精子发生过程中发挥着至关重要的作用,Zfy基因位于Y染色体短臂上,编码锌指蛋白,最新研究中被确认决定圆形精子能否最终发育成为可供自然受精的精子,与Y精子的正常发生有关。马鹿作为特种经济动物在新疆生产建设兵团有多年养殖历史,马鹿养殖效益核心是鹿茸的销售,公鹿的大量繁殖和饲养是鹿场主要运营模式。然而鹿茸市场波动频繁,去母留公在鹿茸市场疲软时属于常态,而随着市场转暖,通过控制马鹿后代性别,在短时间内多生母鹿达到快速扩繁的目的,当母鹿存栏量达到一定基数时再控制多生公鹿,是鹿场在市场激烈竞争中降低成本提高收益的重要手段。目的:设计马鹿Zfy基因shRNA片段,构建并筛选出高效马鹿Zfy基因shRNA表达载体,将所筛选出的重组载体注射进种公鹿睾丸内,以期在配种时间内干扰、抑制睾丸内Zfy基因表达,影响Y精子的正常生成,而不影响X精子的生成,为X精子提供更多的受精机会,从而达到多生母鹿的效果。方法:(1)对马鹿Zfy基因mRNA序列进行siRNA设计和筛选,将筛选出的siRNA分别连接到RNA干扰真核表达载体中,将构建好的重组表达载体进行马鹿体外生精细胞培养RNAi试验,利用qPCR检测mRNA的表达水平变化,筛选出高效的shRNA表达载体。(2)选取健康公鹿5只,母鹿共67只,将筛选出的重组质粒按比例稀释后分别注射到5只公鹿睾丸内,注射完成后,将5只公鹿随机赶入5个母鹿圈舍(每个圈舍有9~14只母鹿),自然发情交配。在母鹿妊娠期为12~14周时,提取孕鹿胎儿游离血浆DNA,利用常规PCR方法对牙釉蛋白基因片段扩增,根据片段特点鉴定胎儿性别,统计并分析胎儿性别比例,同时统计近几年该鹿场的性别自然比例作为对照组,分析数据得出该重组质粒体内RNAi试验后代性别偏移率。结果:(1)依据siRNA的设计原则筛选出4对特异性siRNA序列,构建了2个靶向Zfy基因的shRNA表达载体(重组表达载体1、重组表达载体2),通过qPCR检测,重组表达载体2的Zfy基因的干扰效率为79%,与空载体相比差异极显著(P<0.01),而重组表达载体1和空载体相比,差异不显著(P>0.05)。(2)将筛选出的Zfy重组表达载体2进行马鹿体内RNAi试验,通过胎儿性别鉴定方法,得到胎儿的雌性率为70%,与对照组差异极显著(P<0.01)。结论:(1)所构建的重组质粒2对Zfy基因的mRNA表达有极显著下调作用,可用于马鹿体内RNAi试验。(2)重组质粒2体内RNAi试验极显著影响了马鹿后代的性别比例,提高了后代雌性的数量。