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研究背景及意义:东方蝾螈具有很强的再生能力,是肢体再生的理想模式物种。蝾螈肢体再生涉及多种复杂的生物学过程,肢体再生的不同阶段会激活不同的基因、启动不同的信号通路、合成不同的蛋白质、形成不同的组织。尽管已有组织学、细胞学、生物分子和信号通路调控作用等方面的研究,有助于我们深入了解蝾螈肢体再生的过程,但肢体再生的分子机理仍不清楚。本研究利用高通量测序对蝾螈肢体再生中的转录组、蛋白组和miRNA组进行分析,揭示了蝾螈肢体再生动态调控过程,为探讨蝾螈肢体再生的调控机制,提供了重要的理论依据。研究方法:本研究以东方蝾螈截肢后五个不同再生时间点(3 dpa、7 dpa、14 dpa、30 dpa和42 dpa)的再生肢体组织为研究对象,建立东方蝾螈肢体再生模型。1、利用RNA-seq技术,获得东方蝾螈肢体再生转录组数据,筛选出肢体再生过程中差异表达的关键转录因子,并通过qPCR进行验证。2、利用iTRAQ联合LC-MS/MS技术,获得东方蝾螈肢体再生的蛋白表达谱,筛选差异表达蛋白,并进行GO和KEGG富集分析。3、利用miRNA-seq测序技术,对肢体再生中的miRNA进行发掘分析,对所有差异表达的miRNA进行了靶基因预测;结合转录组数据和蛋白组学数据,进行整合分析,构建差异表达miRNA-mRNA-protein的相互作用网络。4、对差异显著基因进行序列分析,制备肢体再生过程中差异表达蛋白的多克隆抗体。通过Western blot和免疫荧光染色对差异基因的表达和定位进行研究。结果:1、肢体再生过程中的转录组研究:共检测到154790个基因,通过与对照组相比较,去冗余后筛选出705个差异表达基因,其中7 dpa最多为539个。通过聚类分析,424个基因在3,7和14 dpa表达上调,在52个基因在30和42 dpa表达上调,229个差异表达基因表达下调,这些差异基因参与22个生物学过程、10个细胞组分和10个分子功能,被分配到了116条不同的KEGG通路。在再生过程中发生显著改变的基因大部分与细胞进程、生物调节、发育和免疫系统等密切相关。2、肢体再生过程中的蛋白组学研究:共鉴定到2636个蛋白。通过与对照组相比,253个蛋白在肢体再生过程差异表达,其中153个蛋白显著上调,87个蛋白显著下调。13个蛋白存在上调/下调的变化趋势。GO富集分析表明,差异蛋白参与到23个生物学过程、9个细胞组分和11个分子功能中;KEGG分析富集到29条信号通路。功能分析表明,这些差异表达的蛋白与代谢、伤口愈合、细胞过程蛋白、结合和免疫反应有关。3、肢体再生过程中的microRNA组学研究:共鉴定到1171个miRNA,包括534个已知miRNA和637个新候选miRNA,通过与对照组比较共发现203个差异miRNA;对所有差异表达的miRNA进行了靶基因预测;结合我们获得的蛋白组学数据,对三个组学进行整合分析,构建差异表达miRNA-mRNA-protein的相互作用网络。GO注释和KEGG分析表明,差异表达的miRNA靶点主要针对细胞骨架重构和碳水化合物代谢。通过双荧光素酶报告基因检测miR-223和miR-133a对靶基因具有负调控作用。4、肢体再生过程中差异显著性基因组学结果验证:根据转录组和蛋白组学数据以及qPCR验证结果,对差异显著基因(Coro1a、Capg、Anxa1和Agr)进行物种间序列比对和系统进化树的构建,制备了肢体再生过程中差异表达蛋白(CORO1A、CAPG、ANXA1和AGR)的多克隆抗体。通过Western blot进行验证,结果发现,目标基因表达量均在截肢后发生了显著上调。通过免疫荧光染色发现,CORO1A、CAPG和AGR蛋白在胞浆中表达,而ANXA1蛋白主要在细胞膜上表达。