一、研究目的及意义有研究报道通过药物相继作用分别诱导M期阻滞(M-arrest)和M期滑移(M-slippage),这种序贯联合诱导肿瘤细胞凋亡会形成协同增效、增敏的效应；CDK1抑制剂可促进M-slippage发生,故能逆转M-slippage机制缺陷的肿瘤细胞对紫杉醇等有丝分裂拮抗剂(可诱导M-arrest)的耐药性。课题组前期工作已证实吴茱萸碱能诱导肿瘤细胞凋亡,诱导M-arrest的发生,吴茱萸和青黛的联合对小鼠肝癌移植瘤有明显抑瘤效应。本研究探讨吴茱萸碱与CDK1抑制剂——R03306、靛玉红甲肟联合,能否基于M-arrest与M-slippage机制产生协同作用诱导肿瘤细胞凋亡,比较吴茱萸和青黛以序贯联合和反序贯联合的不同加药方式,对小鼠肝癌移植瘤的抑瘤效应,以期获得不同中药/成分通过生物机制相互作用而产生的抗肿瘤协同增效效应。二、研究方法1MTT方法检测吴茱萸碱、紫杉醇、R03306、靛玉红甲肟不同浓度或者不同时间单独对人肝癌HepG2细胞及人结肠癌HT29细胞的影响；MTT方法检测吴茱萸碱联合R03306对人肝癌HepG2细胞及人结肠癌HT29细胞的影响；MTT方法检测吴茱萸碱联合靛玉红甲肟对人肝癌HepG2细胞的影响；MTT方法检测紫杉醇联合R03306对人肝癌HepG2细胞及人结肠癌HT29细胞的影响；2流式细胞术检测吴茱萸碱、靛玉红甲肟不同浓度不同时间对人肝癌HepG2细胞周期的影响；3PI和DAPI染色方法检测靛玉红甲肟不同浓度不同时间对人肝癌HepG2的形态与数量上的变化。4建立小鼠肝癌H22细胞移植瘤,吴茱萸和青黛以序贯联合和反序贯联合的方式加药,设空白组、模型组、环磷酰胺阳性对照组、吴茱萸组、青黛组、序贯联合组、反序贯联合组。比较各组瘤重和抑瘤率。三、研究结果1吴茱萸碱0.5μmol/L、1μmol/L、2μmol/L、4μmol/L对人肝癌HepG2细胞作用24小时的抑制率分别是9.88%、21.98%、37.46%、45.28%,呈现出浓度依赖性。24小时的IC50约为4μmol/L,起效浓度为1μmol/L。2紫杉醇0.001μmol/L、0.01μmol/L、0.1μmol/L、1μmol/L对人肝癌HepG2细胞作用24小时的抑制率分别是10.27%、24.20%、39.24%、48.37%,呈现出浓度依赖性。24小时的IC50约为1μmol/L,起效浓度为0.01μmol/L。3靛玉红甲肟10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L对人肝癌HepG2细胞分别作用24、48、72小时,结果表明其具有抑制作用,且呈现出时间和浓度的依赖性。HepG2细胞经0、10、20、40μmol/L浓度的靛玉红甲肟作用24小时后,G0/G,期细胞比例逐渐下降,S期细胞无明显变化,G2/M期细胞比例逐渐上升。凋亡率不断上升,分别为2.71%,12.36%,19.43%,29.53%。正常情况下,HepG2细胞贴壁生长细胞饱满均匀,而在靛玉红甲肟的作用下,贴壁细胞不断减少,细胞核染色质深染,聚集于核膜下呈新月形,细胞膜突起呈小泡样,小泡脱落形成含核小体片段的凋亡小体。4吴茱萸碱联合RO3306(8μmol/L)对人肝癌HepG2细胞在吴茱萸碱浓度小于1μmol/L时是出现相加或者协同的效应,但是2μmol/L以上时随着吴茱萸碱浓度的不断增大,却达不到原有的单一的吴茱萸碱用药的作用,即开始出现拮抗的效应。5吴茱萸碱1μmol/L、2μmol/L、4μmol/L联合靛玉红甲肟(8μmol/L)对人肝癌HepG2细胞作用24小时,其抑制率分别是15.71%、20.70%、41.31%。流式细胞仪分析细胞凋亡指数,HepG2细胞分别加入2μmol/L吴茱萸碱,4μmol/L靛玉红甲肟,以及含2μmol/L吴茱萸碱和4μmol/L靛玉红甲肟混合液作用24小时后。其凋亡指数分别为对照组1.00%,吴茱萸组22.01%,靛玉红甲肟组1.70%,联合组14.06%。吴茱萸碱联合靛玉红甲肟对人肝癌HepG2细胞同时用药出现拮抗的效应。6紫杉醇联合RO3306(8μmol/L)对人肝癌HepG2细胞在紫杉醇浓度小于0.04μmol/L时是出现相加或者协同的效应,但是随着紫杉醇浓度的增大,却达不到原有的单一紫杉醇用药的作用,开始出现拮抗的效应。7吴茱萸碱1.875μmol/L、3.75μmol/L、7.5μmol/L、15μmol/L、30μmol/L、60μmol/L、120μmol/L、240μmol/L对人结肠癌HT29细胞作用24小时,其抑制率分别是-2.29%、0.70%、7.40%、20.42%、31.57%、31.85%、43.54%、45.31%;呈现出一定的浓度依赖性,当其浓度在15μmol/L以上时抑制率表现出具有统计学意义,即起效浓度为15μmol/L,IC50约为250μmol/L。8紫杉醇0.5μmol/L、1μmol/L、2μmol/L、4μmol/L、8μmol/L、对人结肠癌HT29细胞作用24小时,其抑制率分别为28.86%、54.48%、57.69%、85.25%、97.43%。呈现出一定的浓度依赖性,24小时的半数致死浓度工C5。约为1μmol/L。9RO3301μmol/L、5μmol/L、25μmol/L、125μmol/L对人结肠癌HT29细胞作用24小时,其抑制率分别为3.76%、3.64%、15.36%、16.77%,可以看出R03306对人结肠癌HT29细胞的生长有一定的抑制作用,但在24小时内高浓度组相差不大,随着浓度继续增大抑制率并不会明显增大。若用相同浓度的RO3306(25μmol/L)对人结肠癌HT29细胞分别作用24、36、48小时的话,其抑制率分别为18.52%、30.47%、32.87%,可见随着时间的增大,抑制率也会有所上升,但在作用36小时后相差不大,随着时间继续增加抑制率并不会明显增大。10先用吴茱萸碱(30μmol/L)分别作用18、30、42小时,再用吴茱萸碱(30μmol/L)联合RO3306(25μmol/L)对人结肠癌HT29作用6小时,其抑制率分别是18.51%、24.2%、31.47%。对比单纯使用吴茱萸碱作用,序贯吴茱萸碱联合R03306对人结肠癌HT29细胞的生长的抑制作用还不如其作用效果,即产生了拮抗作用。若先用吴茱萸碱(30μmol/L)作用18、30、42小时,再用吴茱萸碱(30μmol/L)联合RO3306(25μmol/L)对人结肠癌HT29作用12小时,其抑制率分别是33.41%、36.54%、38.75%。即便是提高联合中的R03306作用时间,其对人结肠癌HT29细胞的生长的抑制作用仍然是产生了拮抗作用。如果同时把吴茱萸碱(30μmol/L)联合RO3306(25μmol/L)一起作用24、36、48小时,其抑制率分别是21.3%、27.78%、35.86%；同时把吴茱萸碱(30μmol/L)联合RO3306(25μmol/L)一起作用30、42、54小时,其抑制率分别是32.92%、37.74%、44.41%。对比单独使用吴茱萸碱来说,不管是在序贯或者同时用药的条件下,调整吴茱萸碱或者R03306的用药时间,都达不到协同效果,反而出现了拮抗。11先用紫杉醇(1μmol/L)分别作用18、30、42小时,再用紫杉醇(1μmol/L)联合RO3306(25μmol/L)对人结肠癌HT29作用6小时,其抑制率分别是14.49%、47.14%、54.24%。对比单纯使用吴茱萸碱作用,序贯紫杉醇联合R03306对人结肠癌HT29细胞的生长的抑制作用还不如其作用效果,即产生了拮抗作用。若先用紫杉醇(1μmol/L)作用18、30、42小时,再用紫杉醇(1μmol/L)联合RO3306(25μmol/L)对人结肠癌HT29作用12小时,其抑制率分别是26.03%、45.97%、70.84%。即便是提高联合中的R03306作用时间,其对人结肠癌HT29细胞的生长的抑制作用仍然是产生了拮抗作用。如果同时把紫杉醇(1μmol/L)联合RO3306(25μmol/L)一起作用24、36、48小时,其抑制率分别是14.97%、54.29%、65.51%;同时把紫杉醇(1μmol/L)联合R03306(25wnol/L)一起作用30、42、54小时,其抑制率分别是47.52%、56.18%、70.23%。紫杉醇联合R03306对人结肠癌HT29细胞在序贯或者同时用药的条件下,调整紫杉醇或者R03306的用药时间,都达不到协同效果,反而出现了拮抗。12对于动物实验方面,我们使用吴茱萸联合青黛对肿瘤造模小鼠进行灌胃治疗,发现单纯吴茱萸水煎液对小鼠移植性肝癌肿瘤确实有一定的效果,而在此基础上加上青黛的话,只有在接种肿瘤一开始,即老鼠肿瘤处于初期时,才会有效果。然而,如果在使用单纯吴茱萸水煎液一段时间后,再加入青黛联合用药,并不产生联合的效果,作用效果反而会比单纯使用吴茱萸水煎液的效果弱。另外还发现,如果是在小鼠肿瘤长到中晚期再以此方法进行治疗,并不能达到此效果,说明中药治疗还是对早期肿瘤较有影响疗效较好。四、结论吴茱萸碱、紫杉醇、R03306、靛玉红甲肟对人肝癌HepG2细胞及人结肠癌HT29细胞的生长都具有一定的抑制作用且具有浓度依赖性。相对于吴茱萸碱,紫杉醇作用更为明显,紫杉醇对两种细胞株都较敏感,但吴茱萸碱对人肝癌细胞更敏感。靛玉红甲肟对人肝癌HepG2细胞的生长抑制作用有一定的浓度时间依赖性。而吴茱萸碱和R03306对人结肠癌HT29细胞的生长抑制作用均有一平台区,作用36小时或R03306达到25μmol/L、吴茱萸碱达到120μmol/L以后,其抑制作用似乎就不会随着时间或浓度的增加而增大。吴茱萸碱或者紫杉醇联合CDKl特异的抑制剂——R03306对人肝癌HepG2细胞均有一定协同抑制作用,但是并不是随着浓度的变化而上升,而是在某浓度以下呈现一个协同作用,而当浓度慢慢增加时,却开始出现拮抗的效果。然而对于非特异的CDK抑制剂靛玉红甲肟,当吴茱萸碱与其联合时,并没有产生协同的抑制效果。吴茱萸碱或者紫杉醇联合R03306对人结肠癌HT29细胞也有一定抑制作用,然而无论是延长作用时间或者提高作用浓度,我们都发现联合效果不如单一用药强,即出现了拮抗的情况。对于动物实验方面,使用吴茱萸联合青黛对肿瘤造模小鼠进行灌胃治疗,处于初期时会有效果。另外还发现,如果是在小鼠肿瘤长到中晚期再以此方法进行治疗,并不能达到此效果,说明中药治疗还是对早期肿瘤较有影响疗效较好。因此,药物联合作用究竟是如何的一个过程还需要更多的实验去探索。