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有机磷农药(Organophosphorus Pesticides,OPs)是农业生产中重要的一类杀虫剂,在食品、环境中的残留会对人体健康、环境生态造成危害。作为家族类化合物,有机磷农药种类繁多,毒性机理相同,当多种成分同时存在时,存在较大的累积毒性风险。因此,研发对家族类小分子农药的多残留检测技术是非常有必要的。目前,有机磷农药残留的检测方法有多种,其中免疫学方法以其灵敏、简单、快速、高通量等特点显示出独特的优势。对抗体/抗原的特异性研究表明,抗体对于小分子半抗原的结合,位于抗体轻链和重链交界面的口袋或顶角结构区,口袋区的大小、稳定对抗体的亲和力影响较大;而抗体对大分子抗原(如蛋白)的结合通常位于抗体的轻链和重链可变区的交界面,与小分子的识别机理不同。抗体的识别部位主要由抗体可变区的互补决定区(Complementarity Determining Regions,CDRs)与框架区(Framework Regions,FRs)构成,CDRs对抗体的结合能力具有重要作用,而FRs对抗体结合区结构的稳定与口袋的大小起关键作用,也可对抗体的性质产生影响。本研究对象为家族类小分子化合物,口袋区的大小对于抗体的广谱识别性具有重要影响,因此本研究主要针对抗体单链可变区片段(single-chain variable fragment,scFv)的FR进行了改造与活性研究。利用已获得的可识别8种有机磷类农药的广谱型单克隆抗体细胞株3D2B3,进行了单链抗体的表达与改造,研究结果如下:1、克隆获得抗体可变区基因,并对抗体结构进行了突变模拟分析。抗体/抗原分子模拟对接发现,若抗体的重链FR1的第三位天冬酰胺,第四位缬氨酸突变为谷氨酰胺、亮氨酸,可使抗体的口袋区变大,对提高抗体活性具有理论可能。2、对抗体FR1基因进行了定点突变(第三位天冬酰胺,第四位缬氨酸突变为谷氨酰胺、亮氨酸)与表达,鉴定了突变前后的单链抗体活性。结果表明,突变前后抗体识别农药的种类没有变化,但对个别农药的亲和力差异显著。其中scFv抗体对8种有机磷农药的IC50在1.25-20.701μg/m L之间,而scFv(M)抗体对8种有机磷农药的IC50在1.216-10.740μg/m L之间,除乙拌磷外,scFv(M)抗体对其他7种农药的灵敏度基本都高于scFv抗体。与单克隆抗体相比,单链抗体对8种农药的灵敏度都比较低,而scFv(M)抗体对伏杀磷,甲拌磷,特丁硫磷,马拉硫磷4种农药的识别力均与单克隆抗体相近,其中对马拉硫磷的亲和力甚至提高了两倍。3、建立了基于scFv(M)抗体的ic-ELISA检测方法。对玉米、小麦样品进行加标回收试验,回收率为72%-139%,变异系数低于11%。4、对scFv(M)抗体进行了CHO真核表达。构建了表达载体pCHO1.0-scFv(M),并进行了瞬时表达,经WB鉴定成功获得了可溶性蛋白,但表达量较低,仍需进行表达条件的进一步优化。