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目的构建小鼠IL-1β(murine IL-1β,mIL-1β)全长基因的真核表达载体pIRES2-EGFP-mIL-1β,通过jetPEI介导的H22肝癌细胞转染,观察对肝癌细胞体外增殖活性的影响。建立BALB/c小鼠皮下荷瘤模型,探讨促炎性因子IL-1β在肿瘤细胞中的表达对其生长和浸润行为的影响及与NK细胞天然免疫活性之间的关系,为促炎性因子参与肝脏肿瘤免疫编辑及天然免疫逃逸关系的假说提供理论依据。方法6-8周龄健康BALB/c小鼠腹腔内注射6%淀粉肉汤1ml,24-48小时灌洗腹腔,收集巨噬细胞,LPS(5μg/ml)刺激4小时后,TRIzol试剂盒的方法提取细胞总RNA,在pfu DNA聚合酶作用下利用IL-1β序列特异性上下游引物进行RT-PCR,扩增获取小鼠IL-1β全长基因。PCR产物首先进行电泳分离,然后利用凝胶回收试剂盒纯化,纯化后的PCR产物与pIRES2-EGFP真核表达载体同时进行EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切,1%琼脂糖凝胶电泳分离后,分别回收IL-1β目的基因小片段和表达载体大片段,按照3:1的比例在T4 DNA连接酶作用下37℃连接4h,置65℃20min灭活残余的酶,将连接产物10μl全部转化DH5α感受态细胞,培养过夜后,挑取单菌落,首先进行菌落PCR、质粒EcoRⅠ+XhoⅠ限制性酶谱分析初步鉴定,最后通过DNA序列鉴定完全正确后,获得重组表达载体pIRES2-EGFP-mIL-1β。将pIRES2-EGFP-mIL-1β重组表达载体大量扩增、纯化,利用阳离子聚合物(jetPEI)介导的方法将其转染小鼠肝癌细胞株H22(H22/mIL-1β),并与转染pIRES2-EGFP空载体(H22/mock)的细胞进行对照。48小时后倒置相差荧光显微镜和激光共聚焦显微镜下观察重组载体的表达情况,RT-PCR分析IL-1β表达水平的变化,MTT法分析细胞体外增殖活性的变化及对NK细胞介导的杀伤敏感性的变化。取上述H22/mIL-1β和H22/mock各2×10~5/只接种于8周龄BALB/c小鼠右前肢腋部皮下,建立肝癌荷瘤小鼠模型,动物饲养周期为60-70天,期间每二至三天使用游标卡尺测量肿瘤大小一次,计算体积(tumor volume)记录荷瘤鼠的生存周期(survial time),实验结束时处死所有小鼠,解剖肿瘤和各脏器,观察肿瘤局部浸润和肺部等其他器官转移的情况,同时制作病理切片,进行HE染色。于H22细胞接种的第3周分离肿瘤组织,分别测量两组肿瘤的大小并称重。分离小鼠脾脏淋巴细胞,与野生型小鼠比较,分析其对H22细胞杀伤活性的变化,以NK细胞敏感的YAC-1细胞为靶细胞,进一步鉴定肿瘤细胞表达IL-1β对体内NK细胞天然杀伤活性的影响,同时RT-PCR分析NK细胞表达的NKG2A抑制性受体水平的变化与NK细胞活性的关系。结果①从LPS刺激的小鼠腹腔巨噬细胞中提取总RNA,优化反应条件后,利用高保真pfu DNA聚合酶,RT-PCR扩增出一条长约843bp的条带,与预期的小鼠IL-1β全长cDNA长度相符。PCR产物经EcoRⅠ+XhoⅠ双酶切后与pIRES2-EGFP进行连接,质粒PCR鉴定、EcoRⅠ+XhoⅠ限制性酶谱分析,初步证实获得数个阳性克隆,最后通过DNA序列分析证实,所获得的重组载体中,外源基因的序列与国际生物信息资源库GenBank中登录的小鼠IL-1β完全一致,证明成功构建了小鼠IL-1β的真核重组表达载体pIRES2-EGFP-mIL-1β。②利用阳离子聚合物(jetPEI),将pIRES2-EGFP-mIL-1β表达载体转染小鼠H22细胞,48小时后荧光显微镜下观察,可见细胞发出明亮绿色荧光,表明重组载体能够有效的在H22细胞中表达,利用RT-PCR方法,从转染H22/mIL-1β细胞中扩增出一条明亮的mIL-1β条带,其表达水平明显高于H22/mock细胞,证明该重组载体能够有效的表达促炎性因子IL-1β,可以用于后续的研究和分析。MTT分析证实,转染IL-1β后,H22细胞的体外增殖速度明显加快,体外生存周期延长。细胞毒分析表明,与H22/mock细胞相比,H22/IL-1β细胞对NK细胞杀伤的抵抗能力明显增强,与野生型小鼠脾脏淋巴细胞相互作用时,效靶比20:1时,其杀伤率下降了约16.8%,效靶比40:1时其杀伤率下降了28.1%。③H22/mIL-1β和H22/mock各2×10~5/只接种于BALB/c小鼠皮下,建立肝癌荷瘤小鼠模型,观察肿瘤生长、浸润行为的变化,并对体内NK细胞功能状态进行评价。研究表明,与H22/mock组小鼠相比,H22/mIL-1β转基因组小鼠中肿瘤成瘤的时间明显缩短、体内肿瘤生长加速,3周后其重量比可达1.86/1,局部浸润性强,解剖小鼠肿瘤可见约100%的瘤块包膜不完整,与瘤周组织粘连不可分离,远处转移率高,可达21.6%。同时外周血中淋巴细胞的数量下降,对H22的杀伤能力也有很大程度的降低,效靶比20:1时,其杀伤率下降了约14.9%,效靶比40:1时其杀伤率下降了27.9%。为了进一步分析NK细胞杀伤活性的变化,选择NK细胞敏感的YAC-1为靶细胞,MTT细胞毒分析提示,NK细胞的活性明显降低,效靶比效靶比20:1时,其杀伤率下降了约60.5%,效靶比40:1时其杀伤率下降了20%左右,这一结果提示,外周血淋巴细胞杀伤活性的变化,主要是由于NK细胞杀伤功能降低导致的。利用RT-PCR方法分析NKG2A的表达,提示IL-1β能够显著的促进NKG2A的转录,可能是导致NK细胞功能抑制的重要机制。结论①本研究成功构建了小鼠促炎性细胞因子IL-1β的真核表达载体pIRES2-EGFP-mIL-1β。②该表达载体在H22细胞中能成功地表达mIL-1β,并能够显著促进肿瘤的体外增殖和生存能力,同时使其对NK细胞杀伤的敏感性下降。③本研究成功建立了H22/mIL-1β荷瘤小鼠模型,为体内研究IL-1β对肝癌生长和免疫功能的影响提供了研究平台。④利用该荷瘤小鼠,我们的研究结果提示,肝脏肿瘤分泌促炎性细胞因子IL-1β形成的炎性微环境,是加速肝癌生长、浸润的重要因素,同时也是肿瘤借以抑制NK细胞天然免疫,形成自身免疫逃逸的重要机制。