MicroRNA-596在胃癌中的作用及其调控机制研究

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前言:在全球胃癌发病率居恶性肿瘤的第五位,死亡率居第二位;据统计,2013年中国胃癌发病率为13.31/10万,仅次于肺癌。由于我国胃癌早期诊断率较低,被发现时已进入晚期,导致死亡率较高。因此当前要找到对胃癌诊断治疗更有效的标记物,应需进一步研究胃癌的生物学分子调控机制,才能对胃癌的早期诊断治疗和改善预后起到重要作用。最近研究表明,在个体的生长、发育、分化以及恶性肿瘤发生发展等方面内源性非编码RNA发挥着重要的作用。许多研究发现miRNA在胃癌的发生、发展及预后的进程中可发挥抑癌基因和癌基因的功能。研究还发现,许多miRNAs的异常表达与其基因内部或邻近的CpG岛出现异常甲基化密切相关,有可能对肿瘤的发生发展起重要的调控作用。MicroRNA-596(miR-596)位于人类染色体8p23.3,为基因间的非编码RNA。近年来有研究发现:miR-596在肝细胞癌、胆管癌、口腔癌、子宫内膜癌、膀胱癌、胰腺癌等多种肿瘤中表达下调发挥抑癌基因作用,但是在胃癌中的表达异常调控作用及机制尚不明确。目的:本研究旨在探讨在胃癌细胞和组织中的miR-596表达情况,与相关临床病理特征的关系和在胃癌发生发展中的作用,并研究DNA高甲基化对miR-596表达的影响情况,及miR-596的下游靶基因进行研究。第一部分检测miR-596在胃癌细胞系和胃癌组织中的表达水平,并分析胃癌患者中miR-596表达水平与其临床病理特征的相关性,通过体外过表达miR-596观察其对胃癌MKN-45和MGC-803细胞株增殖、迁移与侵袭等生物学功能的影响,并检测了胃癌细胞系中miR-596启动子区甲基化水平,同时观察去甲基化药物5-氮杂-2-脱氧胞苷(5-Aza-dC)对胃癌MKN-45和MGC-803细胞株miR-596表达和增殖的影响。第二部分研究miR-596调控的下游靶基因,并进一步探索miR-596在胃癌中发挥生物学功能的分子机制。研究方法:1.应用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测miR-596在正常胃粘膜细胞株GES-1及4株胃癌细胞株中的表达情况,同时检测55例配对胃癌及癌旁组织中miR-596表达量并进行统计学分析;2.体外实验,化学合成miR-596 mimics和miR-NC,选用对数生长期胃癌细胞株MKN-45和MGC-803按照实验分组分别使用Lipofectamine3000进行转染,通过CCK-8实验、划痕愈合实验和Transwell小室实验分析过表达miR-596对胃癌细胞增殖、迁移与侵袭等生物学功能上的影响;3.通过甲基化特异性PCR(MSP)检测了正常胃粘膜细胞株GES-1及4株胃癌细胞株中miR-596基因启动子区甲基化状态,采用不同浓度去甲基化药物5-氮杂-2-脱氧胞苷(5-Aza-dC)处理体外培养的胃癌细胞系MKN-45和MGC-803,运用qRT-PCR检测miR-596的表达水平变化,MSP检测miR-596启动子区甲基化状态变化,同时通过CCK-8实验检测了对胃癌细胞增殖活力的影响;4.利用数据库软件进行miR-596潜在靶基因预测;通过qRT-PCR和Westernblot检测靶基因PRDX1在胃癌细胞及组织中的表达情况,并检测胃癌细胞株转染miR-596后其靶基因的表达变化,进一步通过双荧光素酶报告实验验证其结合位点;使用干扰RNA实验沉默PRDX1的表达,应用CCK-8实验、划痕愈合和Transwell小室实验研究沉默PRDX1对胃癌细胞增殖、迁移与侵袭等生物学功能上的影响;最后研究去甲基化药物5-氮杂-2-脱氧胞苷(5-Aza-dC)处理体外培养的胃癌细胞系MKN-45和MGC-803,通过qRT-PCR和Westernblot检测靶基因PRDX1的表达水平变化。结果:1.qRT-PCR结果显示:与胃正常粘膜细胞GES-1相比,miR-596在4株胃癌细胞系中的表达均出现不同程度的下降;miR-596在55例胃癌组织中表达水平显著低于其配对癌旁组织(P<0.001),miR-596低表达与肿瘤细胞的分化程度和TNM分期密切相关。2.体外转染终浓度为50nM miR-596mimics至胃癌细胞株MKN-45和MGC-803中,CCK-8实验结果提示过表达miR-596可抑制胃癌细胞增殖,划痕愈合实验和Transwell小室实验结果表明miR-596过表达可抑制MKN-45、MGC-803细胞迁移和侵袭能力。3.MSP结果显示miR-596在4株胃癌细胞系中,其启动子区CpG岛出现不同亮度的甲基化条带,甲基化程度与其表达水平具有相关性;去甲基化试剂5-氮杂-2-脱氧胞苷(5-Aza-dC)干预72h后,MSP结果表明,应用5-Aza-dC处理后,可逆转miR-596启动子区高甲基化状态;并且qRT-PCR检测发现miR-596表达水平显著升高;同时CCK-8实验结果显示,细胞增殖活力与药物浓度和作用时间呈负相关。4.通过在线靶基因预测软件预测PRDX1可能是miR-596的靶基因之一;qRT-PCR和Westernblot结果显示:PRDX1在胃癌组织中表达水平高于其配对癌旁组织,差异有统计学意义;PRDX1在转染miR-596 mimics后在mRNA水平和蛋白水平的表达量都明显下降;双荧光素酶报告实验显示PRDX1是miR-596的直接结合位点;并且siRNA沉默PRDX1后与miR-596 mimics的生物学功能一致;应用5-Aza-dC处理后,PRDX1蛋白表达明显降低。结论:1.miR-596在胃癌细胞株和胃癌组织中呈明显低表达,过表达miR-596可抑制胃癌细胞增殖、迁移和侵袭能力,其低表达受其基因启动子区高甲基化所调控。2.PRDX1在胃癌组织中表达上调,为miR-596的直接调控靶基因之一。
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