研究背景:神经系统由中枢和周围神经系统构成,脑和脊髓组成了中枢神经系统,是人体神经系统的最主要部分。婴儿大脑发育最为迅速的时期是出生后两年内,此时是神经元细胞功能完善、突触生长和轴突髓鞘化的最重要时期。视网膜为大脑的延伸部分,是视觉信息形成的核心部位。虽然由遗传因素主导的视觉功能在婴儿出生时已经基本形成,但出生后在周围环境、营养和视觉习惯的调控下仍可以对视觉神经系统的功能进行进一步的完善和塑造,因此视觉系统的发育是由遗传、营养和环境因素共同塑造的。婴儿期神经系统的发育需要大量而丰富的营养物质,而在这一时期,婴儿的主要营养物质来源是母乳。母乳是婴幼儿发育早期最佳的营养来源,因为它可以提供婴儿正常生长发育需要的所有营养。此外,母乳同时也富含一些其它营养成分,可能会给婴儿提供超越传统营养的好处。母乳中富含丰富的低聚糖,母乳低聚糖(Human milk oligosaccharides,HMOs)是母乳中非常重要的一部分,它由中性及酸性低聚糖构成。酸性低聚糖,如唾液酸乳糖(Sialyllactose,SL),含有唾液酸(Sialic acid,Sia)残基;中性低聚糖,包括半乳低聚糖和低聚果糖。母乳中73.8%的唾液酸是以低聚糖结合的形式存在的,其中最主要的唾液酸化的低聚糖是3’-SL和6’-SL。6’-SL的浓度在初乳中最高(250-1300 mg/L),此后逐渐降低,然而,3’-SL的浓度则相对稳定(76-300mg/L)。SL被认为在新生儿发育中起到重要的作用,因为它们在抵抗病原体,促进肠道成熟,免疫功能及认知发育中起到重要作用。同时,唾液酸乳糖可在肠道内被分解,从而提供神经发育所必需的营养素——唾液酸。唾液酸(Sialic acid,Sia)是一类带羧基的九碳糖化合物酰基衍生物的通称。1957年,Blix等用弱酸水解方法,从唾液腺黏蛋白中分离出了与Bia’s试剂反应呈紫色的物质,因此命名其为唾液酸。到目前为止已经发现了 50多种唾液酸。唾液酸一般位于糖蛋白和糖脂等大分子的末端,是动物细胞膜上的糖蛋白和糖脂的重要组成部分。唾液酸具有多种生物学功能比如:细胞的增殖,分化和识别;与病原微生物的相互作用有关,参与免疫反应,促进神经系统发育,易化记忆的形成,提高学习能力。在大脑内,唾液酸主要存在于神经节苷脂上。神经节苷脂是最复杂的鞘糖脂,以大脑灰质中含量最高。神经节苷脂在大脑的生物学活性主要体现在其对突触可塑性的调节。突触的可塑性是学习和记忆等高级的神经活动的重要机制。多聚唾液酸(polysialic acid,PSA)是一类线性、均一的,由多聚α2,8连接唾液酸的碳水化合物,它主要通过典型的N-糖苷键附着在脊椎动物神经系统神经细胞粘附分子上。多聚唾液酸通过改变神经系统神经细胞粘附分子的黏附性来调节神经细胞发育、神经导向以及突触连接的形成,从而在神经发育中起到十分重要的作用。它是存在于少数几种糖蛋白(例如:神经细胞粘附分子、鱼子糖蛋白等)中的唾液酸同聚物。基于这些潜在的好处,我们推测唾液酸乳糖和唾液酸能够作用于神经系统,是促进婴幼儿早期脑发育、视觉发育,并能提高其认知功能的非常重要关键营养素。第一部分:唾液酸乳糖摄入对新生仔猪神经发育和学习认知功能的影响研究目的:本课题以新生仔猪为动物模型,通过唾液酸乳糖的饮食干预,进行八臂迷宫行为学训练及测试,评估其学习记忆能力水平,并对其脑部相关脑区进行唾液酸表达水平和相关脑发育通路的分析,探索唾液酸乳糖对仔猪脑发育及对学习记忆的影响,并探讨其中的分子机制。研究方法:将28只3日龄的雄性仔猪随机分配到唾液酸乳糖处理组(n=14)和对照组(n=14),并连续35天在其饮食中加入一定剂量的唾液酸乳糖,其中唾液酸的摄入量为250mg/Kg/d(唾液酸乳糖组)和40mg/Kg/d(对照组)。23-36日龄之间进行八臂迷宫行为学训练及测试,评估其学习记忆能力水平,在39日龄时对其实施安乐死,取其脑部相关脑区进行唾液酸表达水平的分析,并采用PCR-array技术对海马区相关脑发育通路(包括突触可塑性通路的64个基因、神经营养因子通路的55个基因、GABA和谷氨酸盐神经递质通路的20个基因、神经形成通路的64个基因和与唾液酸代谢相关的29个基因)进行分析,通过qRCR、Western blot、ELISA等实验手段对受影响基因研究其转录、翻译及对下游基因的激活情况,探索唾液酸乳糖对仔猪脑发育及对学习记忆的影响,从而推测唾液酸乳糖影响仔猪脑发育和认知功能的分子作用机理。研究结果:膳食中添加唾液酸乳糖(1)对仔猪体重和脑重的增加无显著影响。(2)对仔猪血浆中应激激素Cortisol和ACTH的浓度无显著影响;(3)对仔猪血浆和血红细胞中唾液酸Neu5Ac和Neu5Gc的含量无显著影响;(4)对仔猪海马和前额叶中与神经节苷脂结合及与糖蛋白结合的唾液酸表达有显著影响;(5)减少了仔猪在八臂迷宫训练与测试中的犯错次数并提高了仔猪的学习速度,同时促进了仔猪5-min短时程记忆,以及40-min、3h、16h和48h的长时程记忆的形成;(6)影响了仔猪海马中37个与脑发育相关的基因的表达,其中有16个基因存在显著性差异(P<0.05)且相差倍数>1.1,包括,GABA和谷氨酸盐神经递质通路的4个基因,唾液酸代谢相关的4个基因,神经营养因子通路的2个基因,神经形成通路的5个基因和突触可塑性的1个基因。另外还有21个相差倍数>1.1但显著性差异不明显的基因(0.05<P<0.1),其中包括,突触可塑性的3个基因,唾液酸代谢相关的4个基因,神经营养因子通路的6个基因和神经形成通路的8个基因;(7)显著提高了海马中NTF-3的蛋白表达水平,并激活了NFT-3的受体TrkB和TrkC的表达,从而募集下游效应因子并促进下游CREB的磷酸化,提高了仔猪的认知能力。结论:膳食中添加唾液酸乳糖对仔猪体重和脑重、应激激素浓度以及血浆和血红细胞中唾液酸的含量无显著影响,但是可以显著提高仔猪海马和前额叶中的唾液酸表达水平、仔猪的学习速度和仔猪短时程记忆及长时程记忆的形成。可以影响仔猪海马中多个与脑发育相关的基因的上调,并显著提高了海马中NTF-3的蛋白表达水平,激活了 NFT-3的受体TrkB和TrkC的表达,从而促进下游因子CREB的磷酸化,提高了仔猪的认知能力。进一步说明了唾液酸乳糖是能够促进脑发育和认知功能的关键营养素。第二部分:唾液酸乳糖摄入对新生仔视网膜发育和唾液酸表达的影响研究目的:本研究以新生仔猪为动物模型,通过唾液酸乳糖的饮食干预,研究唾液酸乳糖对仔猪视网膜发育和视网膜中唾液酸表达的影响。研究方法:将28只3日龄的雄性仔猪随机分配到唾液酸乳糖处理组(n=14)和对照组(n=14),并连续35天在其饮食中加入一定剂量的唾液酸乳糖,其中唾液酸的摄入量为250mg/Kg/d(唾液酸乳糖组)和40mg/Kg/d(对照组),通过连续35天在其饮食中加入一定剂量的唾液酸乳糖,观察唾液酸乳糖对其生理发育的影响,在39日龄时对其实施安乐死,取其视网膜和视神经节分析唾液酸表达水平、视网膜形态结构的差异和多聚唾液酸的表达、合成及代谢的相关机制,研究唾液酸乳糖对仔猪视觉发育和唾液酸表达的影响。研究结果:研究结果显示,膳食中唾液酸乳糖的添加对仔猪视网膜的厚度有一定的促进作用,显著提高了视网膜中唾液酸的表达水平,并且可以在一定程度上提高了仔猪视网膜中polySia-NCAM这个与神经发育密切相关的的糖蛋白的表达以及相关基因ST8SiaⅡ、ST8SiaⅢ、ST8SiaⅣ、NCAM和Neuropilin-2的mRNA表达,但组间不存在差异性。这可能是因为本研究所采用的是营养素干预,而不是药物干预,所以并没有从本质上改变相关机制,但是对视网膜的发育仍具有促进作用。同时,采用免疫荧光技术分别对视网膜中PolySia-NCAM与GFAP、PolySia-NCAM与NeuN进行双标记共染后发现,PolySia-NCAM的表达贯穿于视网膜各层细胞中,但主要以GCL、IPL层为主,这与先前的报道是一致的。结论:膳食中唾液酸乳糖的添加对仔猪视网膜的厚度有一定的促进作用,显著提高了视网膜中唾液酸的表达水平,并且可以在一定程度上提高了仔猪视网膜中polySia-NCAM这个与神经发育密切相关的的糖蛋白的表达以及相关基因ST8SiaⅡ、ST8SiaⅢ、ST8SiaⅣ、NCAM 和 Neuropilin-2 的 mRNA 表达。PolySia-NCAM的表达贯穿于视网膜各层细胞中,但主要以GCL、IPL层为主,这与先前的报道是一致的。