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布鲁氏菌病(简称布病)是近年来常见的由布鲁氏菌引起的人畜共患传染病,每年感染者日益增加,发展中国家发病严重,且发病疫区甚至已扩展至部分发达国家,布鲁氏菌病已经对我国畜牧业以及我国的进出口贸易的发展造成严重的阻碍。且严重威胁着人类的公共卫生健康,布鲁氏菌病目前蔓延较快,控制力弱,主要分布在地中海沿岸国家、蒙古、中国、印度等国家。现已有的针对布鲁氏菌病的疫苗的有效性较弱,不足以完全控制住布鲁氏菌病。布鲁氏菌是革兰氏阴性菌属于兼性胞内寄生菌,侵袭力强、传播范围广、人感染布鲁氏菌后造成波浪热、关节炎等症状;母畜感染此病后易造成流产,公畜感染此病后得睾丸炎。布鲁氏菌存在着自己特有的生物活性,具有独特的生物学功能,与宿主的免疫间存在着相互的联系,具有复杂的信号调控网络。但是,人们并没有对布鲁氏菌侵染宿主细胞的免疫系统以及其胞内生存的具体机制的认识还不是很清楚。所以我们对布鲁氏菌是如何削弱宿主细胞的免疫能力和致病机制,将为我们寻找新型的布鲁氏菌控制策略提供新的方向和奠定理论基础。所以我们对牛种布鲁氏菌开展了以下的研究工作:目的:本研究是以光滑型布鲁氏菌2308、粗糙型布鲁氏菌RB51为研究对象,探讨在布鲁氏菌强弱毒株的侵染下NF-κB,JAK2/STAT3信号通路在布鲁氏菌致病过程以及胞内存活的作用机制。(1)光滑型布鲁氏菌2308,粗糙型布鲁氏菌RB51侵染巨噬细胞后确定NF-κB,JAK2/STAT3信号通路的激活状态。(2)分析不同感染时间和不同感染复数对NF-κB,JAK2/STAT3信号通路的激活状态的影响。(3)分析比较加抑制剂后光滑型布鲁氏菌2308,粗糙型布鲁氏菌RB51刺激下细胞因子表达的差异性。(4)分析加抑制剂后光滑型布鲁氏菌2308,粗糙型布鲁氏菌RB51在胞内存活的差异。(5)分析比较加入抑制剂后光滑型布鲁氏菌2308,粗糙型布鲁氏菌RB51对细胞凋亡的影响。方法:1.(1)用光滑型布鲁氏菌2308和粗糙型布鲁氏菌RB51以感染复数为100,侵染巨噬细胞4 h、8 h、24 h和48 h小时后,弃去培养液,加入细胞裂解液裂解细胞吸取上清蛋白,进行Western Blot检测。以此方法同时检测在不同侵染时间和不同感染复数(MOI)时布鲁氏菌2308和RB51侵染巨噬细胞对NF-κB信号通路激活的影响。(2)首先通过台盼蓝染色观察该抑制剂BAY11-7082是否对细胞具有毒性作用。用不同浓度抑制剂孵育巨噬细胞后,牛种布鲁氏菌强弱毒株侵染巨噬细胞然后用ELISA试剂盒检测细胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6的表达量。同时,检测加入信号通路抑制剂BAY11-7082后进行CFU计数,对布鲁氏菌强弱毒株在胞内生存的影响。(3)通过用抑制剂孵育1h后,再用粗糙型牛种布鲁氏菌侵染巨噬细胞用流式细胞仪检测细胞凋亡。2.(1)用光滑型布鲁氏菌2308和粗糙型布鲁氏菌RB51以感染复数为100,侵染巨噬细胞4 h、8 h、24 h和48 h小时后,弃去培养液,加入细胞裂解液裂解细胞吸取上清蛋白,进行Western Blot检测。以此方法同时检测在不同侵染时间和不同感染复数时布鲁氏菌2308和RB51侵染巨噬细胞对JAK2/STAT3信号通路激活的影响。(2)通过台盼蓝染色观察该抑制剂AG 490是否对细胞具有毒性作用。用不同浓度抑制剂孵育巨噬细胞后,牛种布鲁氏菌强弱毒株侵染巨噬细胞,然后用ELISA试剂盒检测细胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6的表达量。同时,检测加入信号通路抑制剂AG490后进行CFU计数,探讨对布鲁氏菌强弱毒株在胞内生存的影响。(3)通过抑制剂孵育1h后,光滑型布鲁氏菌2308,粗糙型牛种布鲁氏菌RB51侵染巨噬细胞,流式细胞仪检测细胞凋亡。3.用纯化的布鲁氏菌LPS和布鲁氏菌LPS-O链缺失株分别侵染巨噬细胞,接着分别检测NF-κB和JAK2/STAT3信号通路的活性。结果:1.(1)粗糙型牛种布鲁氏菌可以强烈的激活NF-κB信号通路,光滑型布鲁氏菌2308则很弱甚至不激活NF-κB信号通路。粗糙型牛种布鲁氏菌RB51侵染巨噬细胞8小时,NF-κB信号通路活性最强,侵染时布鲁氏菌的感染复数对NF-κB信号通路的激活具有浓度依赖性,在感染复数为80侵染时间为8 h时RB51和2308对NF-κB激活程度最强。(2)台盼蓝染色观察该抑制剂BAY11-7082对细胞没有副作用。加入抑制剂后可以抑制细胞因子的产生,且对抑制剂有浓度依赖性;粗糙型布鲁氏菌RB51进入经过抑制剂处理后的巨噬细胞后,细菌数量有明显上升趋势,数量明显高于未处理组。(3)细胞的凋亡率从8.22%下降到7.51%,小幅度下降。2.(1)牛种布鲁氏菌强弱毒株都可以激活NF-κB和JAK2/STAT3信号通路。且在侵染时间为8 h感染复数为80时强烈激活,具有侵染浓度依赖性。(2)台盼蓝染色观察该抑制剂AG 490对细胞没有副作用。加抑制剂后,光滑型牛种布鲁氏菌2308,粗糙型牛种布鲁氏菌RB51可以影响TNF-α、IL-6的表达,不会影响IL-1β的表达。加抑制剂后胞内粗糙型布鲁氏菌数下降明显。(3)加抑制剂后,粗糙型布鲁氏菌RB51细胞的凋亡率从27.76下降到19.34%,而光滑型细胞的凋亡率变化不大。3.用牛种布鲁氏菌强弱毒株纯化的LPS按照浓度梯度侵染巨噬细胞后,NF-κB和JAK2/STAT3信号通路的活性没有明显差异;当用布鲁氏菌M5及其纯化的M5-ΔWbo A的LPS侵染巨噬细胞后,都没有激活NF-κB和JAK2/STAT3信号通路。结论:布鲁氏菌强弱毒株可以不同程度的激活NF-κB和JAK2/STAT3信号通路,从而影响布鲁氏菌的胞内存活和细胞凋亡。而布鲁氏菌LPS对NF-κB和JAK2/STAT3信号通路的激活的影响不大。