肝细胞肝癌是全球范围内最常见的恶性肿瘤之一,全球每年新发肝癌病例约74万人,每年肝癌死亡病例约70万人,其中半数发生在中国,这其中东南沿海又是肝癌的高发地带。目前在临床上治疗肝癌的有效方法只有手术切除,但是患者术后5年的生存率低,复发率高。肝癌组织区别于正常组织的一个显著特点是其毛细血管的大量增生。这是肿瘤组织为适应包膜内低氧环境而诱导血管内皮细胞增殖与迁移的结果。Nogo-B又名RTN4B,是由本课题组科研人员于1998年克隆得到的基因,定位于内质网膜,属于Reticulon (RTN)家族成员。2004年Lisette Acevedo等人在Nature Medicine发表了一篇重要论文,第一次揭示了Nogo-B的N端在血管生成中的重要调控作用。2006年Lisette Acevedo等人又在PNAS上发表文章指出了Nogo-B的N端的特异性受体NgBR在促进血管内皮细胞的趋化性与迁移方面发挥着重要作用。此外,Yasuko Iwakiri的研究指出Nogo-B能够促进小鼠肝硬化的形成,而肝硬化是肝炎向肝癌转变的中间环节。这都提示了Nogo-B与肝癌的发生过程中瘤体内血管形成密切相关。探明Nogo-B在肝癌发生发展过程中促进瘤体内毛细血管形成的机制,对提出肝癌治疗的新靶标以及降低肝癌复发等方面有着重要的意义。我们实验室科研人员的前期工作已经证实：(1)RTN4B在除肝脏以外的15种被检测的正常组织中均有表达,但是在肝癌组织中却异常高表达；(2)过表达的RTN4B肝癌细胞株的裸鼠体内成瘤性显著增加,并且瘤体内血管密度显著增高；(3)敲除肝癌细胞株内源表达的RTN4B可以显著抑制裸鼠皮下成瘤的生长,并且瘤体内血管密度显著降低；(4)抗体封阻的反向实验证实整合素αvβ3是RTN4B促进血管生成所必需的内皮细胞表面分子,ELISA实验证实二者有直接的互作关系。以上发现都提示整合素αvβ3极可能是RTN4B的一种功能性受体。多数整合素与细胞外基质及细胞表面分子互作的主要识别位点是RGD(Arg-Gly-Asp)复合物。然而RTN4B上并不存在RGD结构。经分析,在RTN4B的178位至182位存在着RRGSS (Arg-Arg-Gly-Ser-Ser)五肽序列,该五肽序列在空间结构上与RGD(Arg-Gly-Asp)十分相似,因此推测该五肽序列可能是整合素αvβ3与RTN4B互作的区域。化学合成该RRGSS五肽后,发现其能够竞争结合整合素αvβ3,并在体外抑制血管内皮细胞对RTN4B的粘附,体内能够抑制肿瘤细胞的成瘤性,能够实现对肿瘤生长的抑制作用,具有被开发成抗肿瘤药物的潜力。通过在Sanger法测序体系中加入浓度梯度的甜菜碱,寻找能提高富含三核苷酸重复序列的高G-C含量DNA片段测序结果辨识度的甜菜碱最佳浓度。以G-C%为72%无三核苷酸重复的Nogo-B基因cDNA的5’端序列(Am-Nogo-B)以及G-C%为74%的富含CAG/CCG重复的Huntingtin基因cDNA的5’端序列(Am-HTT)为例,在Sanger法测序体系中加入浓度梯度的甜菜碱,并在长度、质量、峰型方面对测序结果进行辨识度的比较。Am-Nogo-B与Am-HTT基因测序体系中最适宜的甜菜碱浓度相差较大。甜菜碱终浓度在0.8M至1.2M之间时,Am-Nogo-B测序结果质量最佳。甜菜碱终浓度在1.6M至2.4M之间时,Am-HTT基因的测序质量最好。结果具有良好的可重复性。不同碱基组成类型的高G-C含量DNA片段,即使G-C含量接近,最适宜测序体系中甜菜碱浓度不同。终浓度为0.8M至1.2M的甜菜碱可有效增加无三核苷酸串联重复的高G-C含量DNA片段测序结果辨识度,终浓度为1.6M至2.4M的甜菜碱是增加高G-C含量且含三核苷酸串联重复的DNA片段测序辨识度所必需的。本实验所探索出的适宜于增加高G-C含量且含三核苷酸串联重复的DNA片段测序辨识度的体系,可作为类似含有三核苷酸串联重复的高G-C含量DNA片段测序的参考方法。