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砷是人类确定(Ⅰ类)致癌物,通过食用含有无机砷化物的水和食物所引起的砷中毒在全世界广泛存在。另外一方面,砷还是多种肿瘤有效化学治疗药物,因此,环境和医源性接触砷化物的机会大大增加。二甲基肿酸(DMA)是无机砷在人体内的主要的甲基化代谢产物,其本身也广泛用作杀虫剂。传统的观念一直认为砷在体内的甲基化过程是一个解毒促排泄过程,但是最近有研究表明DMA可引起细胞DNA断裂,DNA-蛋白质交联和细胞凋亡,认为DMA具有遗传毒性和致癌性。最近越来越多的研究表明砷的甲基化过程可能不仅仅是个解毒机制,砷在体内的甲基化过程可能在砷致癌过程中发挥重要作用。目前关于砷甲基化代谢产物在体外毒性机制的研究较少,DMA损伤细胞的机制还不太清楚,其中关于信号通路在其中的作用的研究比较少。c-Jun氨基末端激酶(JNK)信号通路是丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)家族信号通路的重要亚通路之一,,其参与调控细胞增殖、分化与凋亡。有研究发现JNK信号通路在无机砷及其化合物所致细胞损伤中发挥一定作用。因此,阐明DMA所致细胞损伤及其分子机制对于探讨砷致癌分子机制及砷中毒的防治具有重要意义。本课题拟探讨不同浓度DMA对人胚肺成纤维细胞(HELF)增殖、DNA损伤、细胞周期和凋亡及JNK信号通路的影响;并应用JNK抑制剂和反义抑制技术构建JNK缺陷HELF细胞,以阻断JNK信号通路来深入探讨JNK信号通路在DMA所致HELF细胞DNA损伤和凋亡中的作用,为进一步揭示DMA所致细胞损伤的分子机制,全面了解砷的致癌分子机制和砷化物对机体的影响提供一定的科学依据。方法一、DMA对HELF细胞增殖的影响用0.0、2.5、5.0、10.0、20.0μmol/L DMA分别处理HELF细胞12、24、48 h,用MTT法和CCK-8法检测HELF细胞相对增殖率,寻找其所致HELF细胞增殖的剂量-效应和时间-效应关系。二、DMA对HELF细胞DNA损伤的影响用0.0、2.5、5.0、10.0、20.0μmol/L DMA分别处理HELF细胞12、24、48 h,收集HELF细胞蛋白,用Western blot检测HELF细胞γ-H2AX蛋白表达水平,并用同一张膜上相应泳道的β-actin条带的灰度进行校正。三、DMA对HELF细胞周期的影响用0.0、2.5、5.0、10.0、20.0μmol/L DMA分别处理HELF细胞48 h或用20.0μmol/L DMA分别处理HELF细胞12、24、48 h,收集细胞,用流式细胞仪检测细胞周期的变化。四、DMA对HELF细胞凋亡的影响用0.0、2.5、5.0、10.0、20.0μmol/L DMA分别处理HELF细胞12、24、48 h,分别用Hoechst 33258法检测HELF细胞凋亡形态学变化及细胞凋亡率和用Western blot检测HELF细胞断裂Caspase 3蛋白表达水平,寻找其剂量-效应和时间-效应关系。五、DMA对HELF细胞磷酸化JNK表达水平的影响用0.0、2.5、5.0、10.0、20.0μmol/L DMA分别处理HELF细胞12、24、48 h,收集HELF细胞蛋白,用Western blot检测HELF细胞JNK、和磷酸化JNK蛋白表达水平,并用同一张膜上相应泳道的β-actin条带的灰度进行校正。六、JNK缺陷HELF细胞株建立从HELF细胞中抽提总RNA,用RT-PCR法扩增目的DNA片段,经重组技术构建JNK基因反义RNA绿色荧光真核表达质粒,将重组质粒转染HELF细胞,经G418筛选后,用Western blot检测JNK蛋白含量,确认获得JNK缺陷HELF细胞株。七、抑制JNK对DMA所致细胞DNA损伤与凋亡的影响预先用20.0μmol/L JNK抑制剂SP600125处理HELF细胞30 min,然后用20.0μmol/L DMA处理HELF细胞48 h,再分别检测HELF细胞DNA损伤和细胞凋亡情况。用20.0μmol/L DMA处理JNK缺陷HELF细胞(asJNK-HELF)和空载HELF细胞(C1-HELF)48 h,再分别检测这两种细胞DNA损伤和细胞凋亡情况。结果一、DMA对HELF细胞增殖的影响HELF细胞相对增殖率在处理12h时10.0和20.0μmol/L DMA组显著低于对照组(P＜0.05);而在24和48h时,5.0、10.0和20.0μmol/L DMA组显著低于对照组(P＜0.05)。结果表明DMA对HELF细胞增殖的抑制呈现剂量-和时间-依赖关系。二、DMA对HELF细胞DNA损伤的影响HELF细胞γ-H2AX蛋白表达水平在处理12h时5.0、10.0和20.0μmol/L DMA组明显高于对照组;在处理24和48h时2.5、5.0、10.0和20.0μmol/L DMA组明显高于对照组。结果表明DMA对HELF细胞产生明显的DNA损伤。三、DMA对HELF细胞周期的影响用DMA分别处理HELF细胞48h后,随着浓度的增加,G0/G1期的比例下降(P分别＜0.05,＜0.01),而S和G2/M期的比例升高(P分别＜0.05,＜0.01):用20.0μmol/L DMA分别处理HELF 12、24、48 h后,随着时间的延长,G0/G1期的比例下降(P分别＜0.05,＜0.01),而S和G2/M期的比例升高(P分别＜0.05,＜0.01)。结果显示DMA能导致HELF细胞周期G2/M期阻滞。四、DMA对HELF细胞凋亡的影响DMA诱导HELF细胞凋亡的形态学改变:凋亡的细胞核呈致密浓染、碎片状,未凋亡的细胞核呈圆形或椭圆形。DMA所致HELF细胞凋亡率在处理12h时5.0、10.0和20.0μmol/L DMA组显著高于对照组(P＜0.05);而在24和48h时,2.5、5.0、10.0和20.0μmol/L DMA组显著高于对照组(P＜0.05)。HELF细胞断裂Caspase 3蛋白表达水平在处理12h时10.0和20.0μmol/L DMA组均明显高于对照组;在处理24时,5.0、10.0和20.0μmol/L DMA组明显高于对照组;在48h时,2.5、5.0、10.0和20.0μmol/L DMA组明显高于对照组。结果显示随着DMA作用浓度增强和时间延长,HELF凋亡情况越明显。五、DMA对HELF细胞磷酸化JNK蛋白表达水平的影响HELF细胞磷酸化JNK蛋白表达水平在处理12h时10.0和20.0μmol/LDMA组均明显高于对照组;在处理24时,5.0、10.0和20.0μmol/L DMA组明显高于对照组;在48h时,2.5、5.0、10.0和20.0μmol/L DMA组明显高于对照组.结果显示DMA处理使JNK产生剂量依赖性地激活(磷酸化)。六、JNK缺陷HELF细胞株建立(一)JNK基因反义RNA绿色荧光蛋白真核表达载体的构建pEGFP-C1-asJNK重组质粒,经酶切鉴定分别获得326 bp DNA片段;测序结果与GenBank中的JNK DNA序列符合率均为100%。结果表明成功构建JNK反义RNA真核表达载体。(二)JNK缺陷HELF细胞鉴定Western blot方法检测空载HELF细胞(C1-HELF)和JNK缺陷HELF细胞(asJNK-HELF)二种细胞中的JNK蛋白水平,发现asJNK-HELF细胞中JNK蛋白含量比C1-HELF细胞降低了72%,说明成功建立JNK缺陷HELF细胞。七、抑制JNK对DMA所致细胞DNA损伤与凋亡的影响(一)JNK抑制剂对DMA所致细胞DNA损伤与凋亡的影响用20.0μmol/L JNK抑制剂SP600125预先处理后,20.0μmol/L DMA所致HELF细胞γ-H2AX和断裂Caspase3蛋白表达水平明显低于仅用DMA处理HELF细胞,细胞凋亡率则降低了49%,差异有显著性(P＜0.05)。结果显示抑制JNK信号通路激活可显著降低DMA所致HELF细胞DNA损伤与凋亡。(二)JNK蛋白缺陷对DMA所致细胞DNA损伤与凋亡的影响用20.0μmol/L DMA处理JNK缺陷HELF细胞(asJNK-HELF)的γ-H2AX和断裂Caspase3蛋白表达水平明显低于仅用DMA处理空载体HELF细胞(C1-HELF),凋亡率则降低了47%差异有显著性(P＜0.05)。结果显示阻滞JNK信号通路可显著降低DMA所致细胞DNA损伤与凋亡。结论1.DMA对HELF细胞产生毒性,即DMA可抑制HELF细胞增殖,损伤HELF细胞DNA,从而引起HELF细胞周期紊乱和HELF细胞凋亡。2.JNK信号通路在DMA所致HELF细胞DNA损伤和凋亡中发挥重要作用,阻滞JNK信号通路可显著降低DMA所致细胞DNA损伤与凋亡。3.成功建立一种JNK缺陷HEFL细胞。