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CRISPR/Cas9系统作为一种高效易行的编辑工具,必然会在未来助力基因治疗的临床转化.病毒载导的CRISPR/Cas9系统在体内外基因编辑中显示了良好的效能.但病毒载体存在基因组整合及插入突变风险,人体应用的安全性受限.目前,非病毒载导CRISPR/Cas9的研究成为热点,纳米材料载导的CRISPR/Cas9递送系统已取得了初步进展.pH 响应性环糊精纳米材料在我校具有深厚的研究背景,既往研究证实,环糊精纳米材料可高效转染小分子 RNA、包载药物及酵母微囊靶向治疗心血管、肿瘤及炎症性疾病.该纳米粒具备优越的体内运输效能,可促进材料免疫逃避和吞噬,其独特的 pH响应释放活性还可介导载体的体内靶向性.pH 响应性纳米材料兼具体内延长循环及缓慢释放等特性,尤其适合肿瘤的靶向治疗.鉴于目前尚无pH响应性环糊精纳米材料递送CRISPR/Cas9复合物的研究报告,我们拟构建CRISPR/Cas9 mRNA复合物负载pH响应性纳米的递送系统,初步探索该纳米体系递送CRISPR/Cas9分子的可行性,以期构建高效的CRISPR/Cas9体内递送系统,为肿瘤的基因靶向治疗提供新的策略和途径. 研究方法： 1.构建靶向敲除HPV18 E6或E7的载体及体外转录mRNA小分子 参阅文献及网站设计靶向HPV 18阳性宫颈癌E6和E7基因的sgRNA序列;运用分子生物学技术构建和验证CRISPR/Cas9载体及体外转录载体.提取质粒行HeLa细胞转染,测序验证载体靶向切割HPV18 E6或E7的基因编辑效能.体外转录Cas9 mRNA及靶向性较好的sgRNA,并进行化学修饰. 2.制备CRISPR/Cas9 mRNA复合物负载的pH响应性纳米递送系统 通过对β-环糊精进行缩醛化反应合成pH响应性缩醛化环糊精(ACD).以ACD为载体材料,通过水包油乳液法制备 CY5 标记纳米粒.采用水包油包水乳液法制备负载CRISPR/Cas9 mRNA复合物的pH响应性纳米递送系统;其中CRISPR/Cas9 mRNA溶解于水相,按1∶1比例配置Cas9 mRNA和gRNA复合物,载体材料ACD溶解于有机相. 检测不同纳米浓度的细胞毒性.进行HeLa、SiHa细胞空纳米吞噬实验,分别于0.5小时、1、3、4、6小时FACS检测CY5标记的纳米转染率.CLSM检测HeLa细胞在6、24、48小时的纳米吞噬穿透.细胞转染CRISPR/Cas9 mRNA复合物负载pH响应性纳米递送系统(pH-NPA)后,通过细胞免疫荧光观测6小时和24小时细胞内Cas9蛋白的表达,12和24小时FACS检测Cas9蛋白表达及变化.体内转染后6和12小时,组织免疫荧光检测瘤组织内Cas9蛋白的表达.同时,通过观察裸鼠体重变化、脏器指数、血常规,肝肾功能等指标,对pH-NPA进行体内毒性监测及评价. 3.体外实验观察pH-NPA对HPV18 E6或E7敲除作用,并与Lipofectamine 3000转染方法进行对比研究 应用pH-NPA和Lipofectamine 3000两种转染方法分别转染HeLa细胞.转染后48小时提取细胞RNA和蛋白, RT-qPCR观察HPV18 E6或E7基因的mRNA表达变化, Western blot观察相关蛋白的表达变化,同时行细胞免疫荧光检测.提取细胞DNA进行Sanger测序,检测CRISPR/Cas9靶向HPV18 E6或E7基因的编辑效能.转染72小时后FACS检测细胞凋亡率,并观察比较两种转染方法诱导细胞凋亡的作用. 4.体内实验探索pH-NPA自组装递送系统抑制肿瘤生长的作用. 裸鼠HeLa皮下移植瘤构建成功后,评价比较pH-NPA和Lipofectamine 3000两种方法载导靶向HPV E7基因的CRISPR/Cas9复合物(2μg/只)的体内编辑效果.本研究采用局部瘤体注射的方法,设生理盐水为阴性对照组.比较两种转染方法对裸鼠移植瘤生长的影响.IHC检测pRB、p21的蛋白表达变化.此外,进行CY5标记的靶向HPV18 E6的体内敲除实验.同法瘤体内注射pH-NPA(4μg/只和2μg/只),生理盐水为对照组.观察pH-NPA(E6)对肿瘤生长的影响.靶向治疗72小时行Tunel肿瘤细胞凋亡原位检测.行CLSM检测组织免疫荧光蛋白表达,观察靶向区域E6和p53蛋白表达与CY5标记共定位情况.另外,移植瘤组织免疫组化法观察 p53、E6 蛋白表达差异,瘤体组织提取DNA,行二代测序. 统计学处理： 采用SPSS17.0软件进行统计分析,每个实验重复3次.数据以均数±标准误(Mean ±SE)的方式呈现.检验方法采用students T检验和单因素方差分析,P<0.05 (*), P<0.01(**)和 P<0.001(***)为差异具有统计学意义. 研究结果： 1.成功构建了靶向宫颈癌HPV18 E6和E7基因的CRISPR/Cas9载体及体外转录载体.并体外转录mRNA小分子,检测其具备生物活性. 2.成功制备了CRISPR/Cas9 mRNA负载pH响应性纳米递送系统.纳米吞噬实验显示其具备较高的转染效能.体内体外实验结果显示CRISPR/Cas9 mRNA负载pH响应性纳米后,细胞内可表达Cas9蛋白,Cas9蛋白随时间延长而逐渐降解.该纳米材料未显示体内毒性. 3.体外实验证实CRISPR/Cas9 mRNA负载pH响应性纳米递送系统可有效进行基因编辑,下调HPV18 E6和E7基因mRNA和蛋白表达,诱导细胞凋亡.Sanger测序证实gRNA区域存在基因编辑.与Lipofectamine 3000转染方法比较,CRISPR/Cas9 mRNA复合物负载pH响应性纳米递送系统作用效果更明显. 4.动物体内实验发现,与生理盐水组比较,CRISPR/Cas9 mRNA负载pH响应性纳米和Lipofectamine 3000转染组均可抑制肿瘤生长.CRISPR/Cas9 mRNA负载pH响应性纳米组抑制肿瘤生长作用优于Lipofectamine 3000组.瘤组织免疫组化提示p53、p21、pRB蛋白表达上调.CY5标记区域可见靶向区域E6蛋白表达下降,p53蛋白表达上升.肿瘤细胞凋亡原位检测也提示CY5示踪区域与细胞凋亡共定位.二代测序检测证实E6和E7基因区段存在基因编辑. 研究结论： 1. pH响应性环糊精纳米载体递送CRISPR/Cas9 mRNA具有可行性,可作为基因编辑工具的非病毒载体. 2. pH响应性环糊精纳米粒可单次同时递送Cas9 mRNA和sgRNA小分子复合物,在体内和体外发挥基因编辑效能. 3. CRISPR/Cas9 mRNA复合物负载pH响应性纳米递送系统优于Lipofectamine 3000转染方法,在体内递送中具有优势. 4.纳米材料体内毒性初步评价表明具有较好的体内安全性.