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金铁锁(Psammoilene tunicoides W.C.Wu et C.Y.Wu)来源于石竹科(Caryophyllaceae)单种属多年生草本植物,主要分布于我国云南、西藏、贵州的横断山区。是“云南白药”、“云南红药胶囊”等中成药的重要组成药材之一。金铁锁自然繁殖率低,生长缓慢,近年来野生资源迅速减少,被列为国家二级保护植物。目前,金铁锁采挖量已远远不能满足市场需求,急需对金铁锁进行保护性研究,寻找和扩大新药源。金铁锁的主要有效成分为金铁锁总皂苷,其主要类型为齐墩果烷型五环三萜皂苷,合成途径为甲羟戊酸途径(MVA)。三萜类骨架合成后,依赖细胞色素P450单加氧酶及糖基转移酶对萜类骨架进行结构修饰,最终获得多种多样的三萜类皂苷产物。因此,细胞色素P450是金铁锁皂苷合成途径中的关键酶基因。获得与金铁锁皂苷合成相关的细胞色素P450基因对提高金铁锁总皂苷含量,保证金铁锁资源可持续利用具有重要意义。本实验通过RT-PCR和c DNA末端快速扩增(RACE)的方法分离了金铁锁细胞色素P450基因的全长c DNA,并得到以下结果:1.提取了金铁锁根部总RNA,通过RT-PCR获得CYP85A1、CYP88A3、CYP88A4、CYP716A12及CYP716A53v2共5个CYP450基因的核心片段。2.通过RACE的方法获得了CYP88A4及CYP85A1两个CYP450基因的全长c DNA。其中CYP85A1基因c DNA全长1665bp,ORF长1156bp,编码385个氨基酸;CYP88A4基因c DNA全长989bp,ORF长841bp,编码280个氨基酸。3.从转录组数据中成功拼接出包含有完整开放阅读框的CYP90A1基因,CYP90A1基因全长2115bp,其中ORF长1427bp,编码475个氨基酸,并依据转录组数据设计引物成功扩增出该基因全长