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脊髓缺血再灌注（ischemia-reperfusion,IR）损伤是脊柱、脊髓外伤或胸腹主动脉瘤切除术后的严重并发症,其导致截瘫、下肢麻痹等神经功能障碍严重危害了患者的康复和生活质量。据报道,氧化应激及其诱发的神经炎症反应、神经元凋亡是脊髓IR损伤的重要致病机制。然而,目前临床常用的抗氧化剂等器官保护药物,由于缺乏脂溶性、分子量巨大等缺点,对脊髓IR损伤的治疗效果不佳。甲烷（CH4）是天然气、沼气等的主要成分,也是结构最简单的烷烃类有机物,分子量小,脂溶性高,来源丰富。传统观念认为,甲烷是一种“生物惰性”气体,不会影响机体的生理功能。但是近期的研究表明,甲烷可减轻肠、肝、心脏、视网膜和腹部移植皮瓣等器官、组织的IR损伤,同时对急性自身免疫性肝炎、细菌性脓毒症、内毒素休克、溃疡性结肠炎、糖尿病性视网膜病变、一氧化碳中毒后迟发性脑病和一次性力竭运动后骨骼肌氧化损伤等疾病也有保护效应,表现出抗氧化、抗炎症和抗凋亡的特性。核因子E2相关因子2（nuclear factor erythroid-derived factor 2-related factor,Nrf2）是机体调节氧化应激的关键转录因子,启动抗氧化酶、II相解毒酶的基因转录和表达,并受Kelch样ECH相关蛋白1（Kelch-like ECH-associated protein 1,Keap1）负性调控。研究表明,诱导Nrf2信号激活是调控神经系统抗氧化、抗炎症和抗凋亡的重要保护策略。根据目前的研究进展及国内外研究现状,本研究提出以下问题:甲烷对脊髓IR损伤是否有保护作用?治疗剂量甲烷在体内的安全性如何?甲烷是否通过抗氧化、抗炎症和抗凋亡的生物学效应发挥对脊髓IR损伤的保护作用?Nrf2信号通路是否参与调控甲烷的抗氧化、抗炎症和抗凋亡作用?回答以上问题是本研究的目标。甲烷在气体状态易燃、易爆,不利于贮存、运输与应用。为克服此不足,本人根据高压环境有助于甲烷在水中溶解,而且不改变其化学和生物学性质的特点,制备出甲烷饱和生理盐水（methane-rich saline,MS）。本课题以MS为甲烷载体,采用大鼠脊髓IR损伤作为疾病模型,开展了以下两个方面的研究:第一部分:甲烷减轻大鼠脊髓缺血再灌注损伤的生物效应及安全性研究目的:探讨甲烷减轻大鼠脊髓IR损伤的生物效应及安全性。研究方法:40只健康雄性清洁级Sprague Dawley（SD）大鼠采用随机数字表法将其分为5组（n=8）:假手术组（Sham组）、脊髓IR损伤组（IR组）、MS-1组、MS-5组和MS-10组。Sham组大鼠实施假手术,经右股动脉逆行置入Fogarty球囊套管至胸降主动脉起始部,但不阻断缺血;IR组采用阻断胸主动脉合并体循环低血压的方法诱导脊髓缺血9 min,然后恢复灌注,建立大鼠脊髓IR损伤模型,未实施任何治疗措施;MS-1组、MS-5组和MS-10组脊髓IR损伤大鼠于再灌注即刻分别经腹腔注射1、5和10 ml/kg MS。于缺血前,缺血开始后5 min,再灌注开始后10、30 min时分析动脉血氧分压（PaO2）,动脉血二氧化碳分压（PaCO2）、pH值、血糖和血细胞比容;于再灌注12、24、48、72 h时测量各组大鼠L36节段脊髓组织中的甲烷浓度,评价后肢运动-感觉障碍指数（motor sensory deficit index,MSDI）;于再灌注72 h时观察脊髓神经元存活与凋亡情况,测定脊髓伊文思蓝（evans blue,EB）荧光强度、含量以反映血-脊髓屏障（blood-spinal cord barrier,BSCB）通透性,以及脊髓含水量。研究结果:9 min脊髓缺血可引起大鼠后肢运动-感觉障碍,MSDI升高,并导致神经元凋亡、BSCB通透性增加和脊髓水肿。腹腔注射5、10 ml/kg MS能显著提升脊髓组织中的甲烷浓度,明显降低脊髓IR损伤大鼠后肢MSDI,促进L36段腰段脊髓灰质前角、中间带和后角神经元存活,减少神经元凋亡、BSCB通透性和脊髓水肿,并且其生物效应随剂量增加而逐渐增强。腹腔注射1 ml/kg MS,脊髓组织中的甲烷浓度较低,对MSDI、神经元凋亡、BSCB通透性和脊髓水肿无缓解作用。以上3种剂量MS对动脉血Pa O2、PaCO2、pH值、血糖、血细胞比容均无不良影响。结论:甲烷可减轻大鼠脊髓IR损伤,其生物效应呈剂量依赖性,并且安全性良好,提示甲烷可能成为对脊髓IR损伤有效、安全的新型治疗药物。第二部分:甲烷减轻大鼠脊髓缺血再灌注损伤的机制探讨研究目的:探讨甲烷减轻大鼠脊髓IR损伤的机制。研究方法:228只健康雄性清洁级SD大鼠采用随机数字表法将其分为6组（n=38）:假手术组（Sham组）、甲烷治疗假手术组（Methane组）、脊髓IR损伤组（IR组）、甲烷治疗脊髓IR损伤组（IR-Methane组）、鞘内注射Nrf2 siRNA质粒组（Si-Methane组）和鞘内注射control siRNA质粒组（Con-Methane组）。Sham组大鼠实施假手术,经右股动脉逆行置入Fogarty球囊套管至胸降主动脉的起始部,但不阻断缺血;Methane组为Sham组大鼠腹腔注射10 ml/kg MS;IR组采用阻断胸主动脉合并体循环低血压的方法诱导脊髓缺血9 min,然后恢复灌注,建立大鼠脊髓IR损伤模型,未实施任何治疗措施;IR-Methane组是IR组大鼠于再灌注开始即刻腹腔注射10ml/kg MS;Si-Methane组大鼠连续3 d鞘内注射Nrf2 siRNA质粒,每次300μg/kg,每隔24 h注射一次,最后一次鞘内注射后24 h时诱导脊髓IR损伤,其它措施同IR-Methane组;Con-Methane组大鼠连续3 d鞘内注射control siRNA质粒,每次300μg/kg,每隔24 h注射一次,其它措施同Si-Methane组。首先,探讨Nrf2信号在甲烷改善脊髓IR损伤大鼠后肢神经功能,减轻神经元损伤、BSCB通透性和中性粒细胞浸润中的作用。（1）于再灌注12、24、48、72 h时评价各组大鼠后肢MSDI;（2）于再灌注72 h时观察L36节段脊髓神经元损伤情况,测定脊髓EB荧光强度和含量,以及脊髓含水量、髓过氧化物酶（myeloperoxidase,MPO）活性。其次,探讨甲烷激活大鼠脊髓组织Nrf2信号通路及其抗氧化作用。于再灌注12、24、48、72 h时取各组大鼠L36脊髓组织检测:（1）Nrf2的基因转录、蛋白合成、核转位及DNA结合活性;（2）Nrf2负性调控因子Keap1的蛋白表达量;（3）Nrf2下游调控的抗氧化酶和II相解毒酶的活性及蛋白表达,包括超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）、过氧化氢酶（catalase,CAT）、还原型谷胱甘肽（glutathione,GSH）、氧化型谷胱甘肽（glutathione disulfide,GSSG）及血红素氧合酶-1（heme oxygenase-1,HO-1）;（4）神经细胞内超氧阴离子（superoxide anion,O2-）、过氧化氢（hydrogen peroxide,H2O2）含量,以及脊髓组织氧化损伤标记物的水平,包括丙二醛（malondialdehyde,MDA）、8-羟基脱氧鸟苷酸（8-hydroxy-2’-deoxyguanosine,8-OHdG）和3-硝基酪氨酸（3-nitrotyrosine,3-NT）。再次,探讨甲烷上调的Nrf2蛋白在大鼠脊髓神经元、小胶质细胞和星形胶质细胞的表达与定位,以及Nrf2信号在甲烷减轻脊髓IR损伤大鼠神经元凋亡和神经炎症反应中的作用。于再灌注72 h时取各组大鼠L36节段脊髓组织观察以下指标:（1）采用免疫荧光双标染色检测Nrf2蛋白在脊髓前角、中间带和后角的神经元、小胶质细胞和星形胶质细胞中的表达与定位;（2）观察脊髓前角、中间带和后角的神经元存活、凋亡,检测线粒体细胞色素c（cytochrome c,Cyto c）释放至胞浆,以及半胱氨酸天冬氨酸酶-9（caspase-9）、半胱氨酸天冬氨酸酶-3（caspase-3）的活化情况;（3）观察脊髓小胶质细胞、星形胶质细胞的活化状态;（4）检测核因子-κB（nuclear factor-kappa B,NF-κB）p65磷酸化、核转位及DNA结合活性;（5）测定NF-κB调控的炎症因子,包括:肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-alpha,TNF-α）、白介素-1β（interleukin 1β,IL-1β）、CXC趋化因子配体1[chemokine（C-X-C motif）ligand 1,CXCL1]、细胞间黏附分子-1（intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1）的含量,以及基质金属蛋白酶-9（matrix metallopeptidase-9,MMP-9）蛋白表达量和酶活性,测定紧密连接相关蛋白Claudin-5、Occludin、ZO-1蛋白表达量。研究结果:（1）甲烷可显著增加Nrf2的基因转录、蛋白合成、核转位及DNA结合活性,同时显著抑制Keap1蛋白表达,并促进SOD、CAT、GSH、HO-1表达,从而减少GSSG、O2-、H2O2、MDA、8-OHdG和3-NT含量;（2）甲烷上调的Nrf2蛋白在L36脊髓前角、中间带、后角的神经元、小胶质细胞和星形胶质细胞中都有分布,并且大部分位于细胞核;（3）甲烷可显著降低大鼠后肢MSDI,促进L36脊髓灰质前角、中间带和后角神经元存活,抑制神经元凋亡,减少Cyto c从线粒体释放入胞浆,以及Caspase-9、Caspase-3的活化;（4）甲烷可显著抑制L36脊髓灰质前角、中间带、后角的小胶质细胞、星形胶质细胞活化,降低脊髓组织NF-κB p65磷酸化、核转位及DNA结合活性,减少TNF-α、IL-1β、CXCL1、ICAM-1含量及MMP-9活性与蛋白表达,并且相应地增加Claudin-5、Occludin、ZO-1蛋白水平,从而抑制BSCB通透性、脊髓含水量和MPO活性;（5）连续3 d鞘内注射Nrf2 siRNA质粒,可明显逆转上述甲烷对脊髓IR损伤的抗氧化、抗炎症及抗凋亡作用。结论:甲烷可通过激活Nrf2信号通路发挥抗氧化、抗炎症和抗凋亡作用,从而减轻大鼠脊髓IR损伤,提示甲烷抗氧化、抗炎症和抗凋亡的生物效应与Nrf2信号相关。