微小RNA(mi RNA)是近年来发现的在进化上高度保守的一种只有约为21~25个核苷酸(nt)的内源性非编码小RNA,它通过与靶m RNA的3’-UTR互补结合,使靶m RNA被剪切或转录抑制,从而阻碍该mRNA的翻译过程来从表达水平调控基因。m RNAs已日益成为各个领域研究的热点和重点。已知mi R-142-3p能参与调节小鼠乳腺发育及其泌乳的功能调节,但mi R-142-3p在奶牛乳腺上皮细胞中的调节作用未见报道。本实验以mi R-142-3p作为研究对象,奶牛乳腺上皮细胞为实验模型,发掘mi R-142-3p对奶牛乳腺上皮细胞泌乳功能的调节作用,旨在确定mi R-142-3p在奶牛乳腺在泌乳过程中的调控作用,为人工调控奶牛泌乳提供理论依据和方法。因次在理论层面和实践方面有重大益处。结果表明:1)采用q RT-PCR检测不同乳品质奶牛乳腺组织中mi R-142-3p的表达量,结果发现mi R-142-3p在低乳品质奶牛中表达量比较高,在高乳品质奶牛及干奶期奶牛中表达量相似;2)利用免疫荧光技术检测不同泌乳时期及不同乳品质奶牛乳腺组织中PRLR的表达量和分布,发现在高乳品质奶牛乳腺组织中PRLR表达量最高,低乳品质和干奶期PRLR表达量相似;3)在targetscan(http://WWW.targetscan.org)网站进行靶基因预测,然后从中选择prlr作为mi R-142-3p的目标靶基因;将mi R-142-3p的模拟物mi R-142-3p mimics和抑制物mi R-142-3p inhibitor分别转入奶牛乳腺上皮细胞中,q RT-PCR方法检测mi R-142-3p及其靶基因Prlr的变化,mi R-142-3p过表达,Prlr下调;mi R-142-3p抑制,Prlr上调。验证了Prlr是mi R-142-3p的靶基因,与网站预测结果一致。4)利用western blotting检测mi R-142-3p的模拟物mi R-142-3p mimics和抑制物mi R-142-3p inhibitor以及其阴性对照mi R-142-3p mimics NC和mi R-142-3p inhibitor NC分别转入奶牛乳腺上皮细胞中蛋白表达变化,结果发现,mi R-142-3p mimics转染后,PRLR蛋白的表达量降低,其下游与泌乳相关通路的信号分子蛋白AKT、m TOR、STAT5、MAPK、SREBP1、Cyclin D1及酪蛋白表达量均降低,GLUT1表达量无明显变化。mi R-142-3p inhibitor转染后,PRLR蛋白的表达量升高,其下游与泌乳相关通路的信号分子蛋白AKT、mTOR、STAT5、MAPK、SREBP1、Cyclin D1及酪蛋白表达量均升高,GLUT1表达量无明显变化,阴性对照和空白对照无明显变化。说明mi R-142-3p能够通过调控其靶基因PRLR进而调控上述泌乳相关蛋白通路蛋白分子。5)利用免疫荧光技术检测过表达和抑制mi R-142-3p对奶牛乳腺细胞中目标蛋白PRLR表达位置及表达量有影响;利用Edu技术检测奶牛乳腺上皮细胞细胞增殖情况,利用流式细胞术检测细胞周期,通过进行Annexin V和PI双染色观测细胞凋亡情况,结果说明mi R-142-3p对奶牛乳腺细胞的活力以及增殖起抑制作用,而对细胞凋亡起促进作用。沉默mi R-142-3p后对奶牛乳腺上皮细胞进行检测,结果刚好相反。6)采用乳脂肪检测试剂盒、乳糖检测试剂盒对乳腺上皮细胞乳脂肪和乳糖含量进行检测。过表达mi R-142-3p后,细胞培养液中乳脂肪的表达量降低,而乳糖表达量变化不明显;沉默mi R-142-3p后,细胞培养液中乳脂表达量有所升高,乳糖表达量变化不明显。证实mi R-142-3p对乳成分乳脂肪的分泌具有负向调节作用。综上所述,mi R-142-3p通过调控靶基因prlr参与调节奶牛乳腺上皮细胞的泌乳过程,负向调节泌乳信号通路蛋白表达、甘油三酯分泌、细胞增殖能力,促进凋亡,对奶牛泌乳功能具有一定影响。