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微管相关蛋白tau的主要功能是促进微管的组装，维持微管的稳定性。神经元内出现tau蛋白异常聚集体是阿尔茨海默症(Alzheimers disease，AD)的主要神经病理学特征之一，且异常聚集的tau蛋白可以引起神经元的退行性改变。细胞内的tau蛋白主要经泛素-蛋白酶体系统(ubiquitin-proteasome system，UPS)和自噬-溶酶体通路(autophagy-lysosomal pathway, ALP)清除，这两大系统对底物的选择性降解都与底物的泛素化修饰直接相关。泛素C末端水解酶L1(Ubiquitin C-terminalhydrolase L1，UCH-L1)是去泛素化酶家族的成员之一，它在多聚泛素链的水解和泛素的循环利用过程中发挥重要作用，同时研究发现UCH-L1还具有泛素连接酶的活性，能够产生K63链接的泛素链，而K63链接的泛素链与底物蛋白的靶向结合将促进后者经自噬-溶酶体通路的降解，且该过程与K63和HDAC6的结合并激活HDAC6直接相关。本课题组前期研究也发现，细胞和小鼠海马脑片水平抑制UCH-L1的活性或表达，可引起tau蛋白磷酸化和泛素化修饰异常。但迄今尚无UCH-L1与tau蛋白聚集体清除之间的关系的直接报道。 基于以上研究背景，我们拟以稳定转染人tau441异构体的人胚肾293细胞(human embryonic kidney293 cells stabling expressing human tau441,HEK293/tau441)为研究对象，探讨UCH-L1在tau蛋白聚集体清除过程中的作用，并以K63链接的泛素链和HDAC6为靶标，对其作用机制进行探讨。 目的:探究UCH-L1在tau蛋白聚集体清除过程中的作用及其分子机制。 方法:用蛋白酶体活性抑制剂MG132处理细胞24 hr，然后洗脱含有MG132的培养基加入新鲜的培养基继续培养细胞24 hr，最后在洗脱MG132的同时加入UCH-L1活性抑制剂LDN处理细胞24 hr。上述处理结束后，利用免疫荧光技术、免疫印迹技术、免疫沉淀技术、以及HDAC6活性试剂盒检测相关的分子生化指标。 结果:(1) MG132处理细胞24 hr后，tau蛋白和聚集体形成标志蛋白vimentin向核周聚集形成明显的球状聚集体;洗脱MG13212 hr后，tau蛋白和vimentin均呈现出分散表达的趋势，球状聚集体逐渐解体;洗脱MG13224 hr后，核周的球状聚集体消失，tau蛋白和vimentin均匀分布在胞质;洗脱MG132加LDN处理细胞24 hr后，tau蛋白与vimentin在核周共定位，且在核周形成球状聚集体结构。(2)免疫印迹结果显示，与对照组相比，MG132处理组中K63含量增加（P＜0.01）;与MG132处理组相比，MG132洗脱组中K63含量降低(P＜0.01);与MG132洗脱组相比，MG132洗脱加LDN处理组中，K63含量进一步降低（P＜0.01）。(3)免疫沉淀结果显示，与对照组相比，MG132处理组中K63与HDAC6的亲和力增加(P＜0.01);与MG132组相比，MG132洗脱组中K63与HDAC6的亲和力下降(P＜0.05);与MG132洗脱组相比，洗脱MG132加LDN处理组中，K63与HDAC6的亲和力进一步下降(P＜0.05)。(4)用活性试剂盒检测HDAC6活性变化结果显示，与对照组相比，MG132组中HDAC6活性上调(P＜0.01);与MG132组相比，MG132洗脱组中HDAC6活性下调(P＜0.05);与MG132洗脱组相比，MG132洗脱加LDN处理组中HDAC6活性进一步下调(P＜0.05)。同时我们也通过免疫印迹技术检测HDAC6作用底物α-tubulin的乙酰化水平以反映HDAC6活性改变情况，发现其结果与试剂盒检测结果一致。(5)免疫荧光双标记结果显示，与洗脱MG13212 hr和24 hr组相比，洗脱MG132的同时加HDAC6活性抑制剂TBSA组中tau蛋白聚集体清除受阻。(6)免疫印迹结果显示，与对照组相比，MG132处理组中自噬活性标记蛋白LC3-Ⅱ的含量明显升高(P＜0.01);与MG132组相比，洗脱MG132组中LC3-Ⅱ的含量降低(P＜0.01);与洗脱MG132组相比，洗脱MG132加LDN处理组中LC3-Ⅱ的含量进一步降低（P＜0.05）。 结论:上述结果表明，蛋白酶体活性抑制可以诱导tau蛋白聚集体的形成;UCH-L1活性抑制可通过减少K63泛素链的产生，进而导致HDAC6和自噬活性降低，最终抑制tau蛋白聚集体的清除。