ERF转录调控柑橘果实脱绿

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本文以甜橙(Citrus sinensisL.Osbeck cv.Newhall/Hongjiangcheng)和椪柑(Citrusreticulata Blanco cv.Ponkan)为材料,利用生物信息学分析、基因表达、相关性分析、调控效应、基因互作、启动子分析、瞬时过量表达以及转基因等研究技术手段,研究筛选乙烯信号转导下游元件AP2/ERF参与柑橘果实叶绿素降解的相关成员,并解释其对乙烯(40μL·L-1,12h,20℃)处理的应答模式,验证相关成员在柑橘果实中的基因功能,确定叶绿素降解途径相关基因的调控模式。本文可丰富柑橘乙烯脱绿基础理论,并为果实着色的基因工程调控技术提供新途径。主要研究结果如下:  1.基于柑橘基因组数据库(http://www.citrusgenomedb.org),分离得到126个CitAP2/ERF基因(其中ERF亚家族102个,AP218个,RAV4个,Soloist2个),采用MEME分析软件预测出AP2/ERF保守结构域和EAR抑制结构域,并研究了这些CitAP2/ERF基因在不同组织器官和发育阶段果实材料中的表达特性。  2.通过双荧光素酶分析63个CitAP2/ERF成员,发现了CitERF13可诱导叶绿素降解途径CitNYC和CitPPH启动子活性,而CitERF6仅可激活CitPPH启动子活性。进一步以CitERF13为对象,研究发现CitERF13的转录本变化与柑橘果实发育过程的叶绿素降解呈正相关性,并受乙烯调控。研究明确了CitERF13在烟草叶片瞬时过量表达/过量表达转基因均可诱导叶绿素快速降解,并积累PPH的酶解产物(脱镁叶绿酸a)和ROS;利用柑橘果实瞬时表达体系,也进一步验证了CitERF13调控果实脱绿的功能;确定了CitERF13是直接结合叶绿素降解途径相关基因CitPPH的启动子顺式作用元件。  3.在CitERF13研究的基础上,分析了CitERF6转录调控柑橘果实脱绿的机制。明确了果实发育过程CitERF6的转录本与脱绿呈正相关性,并受采后乙烯处理调控,瞬时过量表达均可加速烟草叶片和椪柑果实的叶绿素降解。同时分析发现CitERF6和CitERF13同属于ERF-Ⅱ亚家族,且两者间具有自激活和相互激活效应。通过将35S启动子替换成基因特定的启动子后,双荧光素酶结果显示pCitERF6∷CitERF和pCitERF13∷CitERF13均能有效地转录激活CitERF6和CitERF13的启动子,烟草过量表达表明pCitERF6∷CitERF6和pCitERF13∷CitERF13能加速叶绿素降解。  4.研究认为CitERF6和CitERF13转录因子介导柑橘果实叶绿素降解,并受乙烯激活,CitERF6和CitERF13间的自激活和相互激活活性可能是维持乙烯诱导脱绿这一生物学效应的重要内在机制。
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