目的:三阴性乳腺癌（Triple-Negative Breast Cancer,TNBC）具有预后差、易复发、恶性程度高的特点,对传统治疗方法效果不佳,目前仍缺少有效的靶向治疗方法,临床上急需寻找新的治疗靶点或方法。蛋白酶体抑制剂通过抑制蛋白酶体的活性间接调控NF-κB通路对肿瘤细胞进行杀伤,已在临床上成为治疗多发性骨髓瘤的首选药物,但目前其适应症仍主要为恶性血液肿瘤,针对实体瘤的治疗仍存在许多问题。核输出蛋白（CRM-1）作为极具潜力的肿瘤治疗靶点,已有针对其开发出的抑制剂KPT-330进入临床阶段,主要适应症也是恶性血液瘤而非实体肿瘤。两种抑制剂均能通过抑制NF-κB通路产生抗肿瘤作用,具有潜在的联合用药可能。在本课题组的前期工作中,设计并合成了新型蛋白酶体抑制剂Y219,具有一定的成药性。本研究旨在通过体外和体内模型评价Y219与KPT-330联合使用对三阴性乳腺癌的治疗效果,并探究其作用机制。希望能为三阴性乳腺癌提供新的治疗思路,也能够拓展两种药物的适应症范围。方法:体外研究中首先采用CCK-8法检测Y219以及KPT-330对三阴性乳腺癌细胞系包括MDA-MB-231、HCC-1937、4T1的IC50以及两种药物联合使用的细胞增殖毒性,根据Chou-Talalay方法使用Compusyn软件计算两个药物的联用指数（CI值）。然后通过流式细胞术检测单独或联合使用两种药物对细胞周期及凋亡的影响;使用MDA-MB-231异种移植瘤模型,评价两种药物联合使用的体内抗肿瘤效果。最后,通过免疫组化分析药物联用对肿瘤组织中凋亡及NF-κB通路相关蛋白表达的变化。机制研究中通过Western-Blot分析细胞内周期凋亡蛋白,以及细胞核内外NF-κB通路蛋白,及其下游相关蛋白变化,通过免疫组化检查细胞周期、凋亡以及NF-κB通路相关蛋白在肿瘤组织内的含量及分布。结果:体外实验表明,Y219及KPT-330均对多种乳腺癌细胞系具有较强的杀伤效果。两药联用CI值的计算结果表明,两种药物在人源性MDA-MB-231细胞系与HCC-1937细胞系中都存在着较强的协同作用。此外,通过流式细胞术检测细胞周期及凋亡情况,同样可以发现相比于同剂量的单独用药,二者联用时可以显著增加肿瘤细胞的周期阻滞与凋亡。在MDA-MB-231细胞中,相比于空白组5.9±1.3%,联用组有60.4±3.1%细胞被阻滞在G2/M期。在凋亡检测中联合用药组的细胞凋亡比例分别达到了53.9±2.6%与45.7±1.9%。在HCC-1937检测中结果趋势也均相似。在MDA-MB-231异种移植瘤模型的药效实验中,联用组的肿瘤平均相对增长率低至19.2%,显示出良好的体内抗肿瘤效果。在进一步的机制研究中,通过Western blot可以发现联合用药能够显著调节凋亡相关蛋白的表达,触发Caspase凋亡通路的激活,上调PARP、Caspase-3/8/9切割,降低抗凋亡蛋白BCL-2的表达。上调细胞周期相关蛋白p21、p27、p53等。另外通过对NF-κB通路相关蛋白的检测,我们发现联合用药能够显著降低p65表达,同时增加了细胞内IκB-α的核内聚集现象,该现象在肿瘤组织切片的检测中也得到了验证。同时,通过检测NF-κB通路所调控的下游蛋白表达,发现联合用药能够下调VEGF、MMP-2、IL-8的表达,这些蛋白均与肿瘤的增殖和侵袭过程有着重要联系。根据以上结果可以推测,两药的联用能够同时作用于IκB-α,减少其降解与出核,使之能够更好地降低NF-κB通路的活性,从而产生较好的联合治疗效果。结论:鉴于体外和体内的研究,我们发现蛋白酶体抑制剂Y219与核输出蛋白抑制剂KPT-330的联合使用在体内和体外对三阴性乳腺癌均具有良好治疗效果,初步证明了其联用机制是通过共同提高细胞核内IκB-α的浓度,从而抑制NF-κB通路活性。本研究为三阴性乳腺癌的治疗提供了新的思路与方向。