研究背景：我国肝病的主要发病原因是感染肝炎病毒。流行病学资料表明,我国每年有50万～100万新发病例,而且在全球约3.5亿以上慢性乙型肝炎病毒携带者中,中国人占80%。在HBV感染者中,有10%～15%的患者可发展为慢性HBV感染,从慢性肝炎发展为纤维化一般只需2～6年时,其中25%～40%的病例最终发展为肝硬化乃至肝癌。研究肝炎的发生机理及寻找有效的治疗措施是国内外学者共同研究的热门课题,大量研究表明,免疫功能的异常改变和氧自由基的大量产生是引起肝组织损伤的重要原因。西医用于肝炎的治疗多见于抗病毒药、免疫调节药及护肝降酶类药物,目前临床上常用的品种有干扰素、阿糖腺苷、干扰素诱导剂聚肌胞、无环鸟苷、左旋咪唑、转移因子、辅酶Q、胸腺素、右旋儿茶素、甘草甜素、齐墩果酸、葫芦素B、葫芦素E、联苯双酯、维生素类等。临床治疗结果表明,这些药物多具有良好的抑制病毒复制,恢复正常肝功能,保护肝细胞等作用,并且疗效迅速,不足之处为远期疗效不稳定,易反复,HBsAg转阴率低,有些药品价格昂贵和表现一定的副作用。中医对肝炎的认识常见于胁痛、黄疸、积聚及虚劳等病症中。其病因为湿热疫毒或先天胎毒,病机特点为湿热羁留、肝胆不疏,脾胃受损。蔡春江等提出慢性乙肝属伏邪致病,伏邪为“浊”、“毒”之邪,病位在肝,邪伏部位为血分,浊、毒之邪与慢性乙肝关系密切,既是病理产物,又是致病之因。刘兴家等认为乙型肝炎病毒的侵入是致病的主因,而湿热与肝郁是一种诱因。陈良金等认为慢性乙肝的病理基础可概括为郁、湿、热、毒、痰、瘀、虚；病位主要在肝,涉及到脾、肾二脏。裴建宏从中医病因理论着眼,认为慢乙肝的病因当属疫气范畴,其病理属性为湿热疫气侵袭,胶固难解,损及肝脾,伤及气血阴阳,并在病情发展过程中出现正邪盛衰演变的复杂病理格局,病势迁延难愈。陈华东等认为病毒性肝炎急性期以湿热疫毒为主,尤其热重于湿；慢性期则因失治、误治、久治不愈而致毒邪滞留,以湿为主。以具有解毒活血祛湿、滋补肝肾、健脾益气之效的药物予以治疗。中医中药具有不良反应较少,可长期服药的特点。近年来,中药治疗HBV感染取得了良好的疗效。多聚糖(polysaccharide),简称多糖,常由一百个以上甚至几千个单糖基通过糖苷键连接而成的,其性质已大不同于单糖,如甜味已经基本消失,广泛存在于动物细胞膜和植物、微生物的细胞壁中,是构成生命的四大基本物质之一,与生命功能的维持密切相关。到目前为止,已有几百种多糖从自然界被分离和提纯,多糖不仅是生命有机体的重要组成成分,还具有广泛的生物活性,如免疫调节、抗炎、抗病毒、抗肿瘤、抗凝血、抗氧化、抗辐射、抗衰老、降血糖、降血脂、保肝、抗寄生虫等。多糖作为非细胞毒性物质,对正常细胞几乎无毒副作用。目前已对数十种多糖进行了含量测定,乌头多糖、东当归多糖、石斛多糖、桔梗多糖、人参多糖、细叶蓟多糖、柴胡多糖、猪苓多糖、红松果多糖、菟丝子多糖、胎盘脂多糖、黔产党参多糖、文蛤多糖、石仙桃多糖、肉苁蓉多糖、胖大海多糖、黄精多糖、耳叶牛皮消多糖、石菖蒲多糖、海藻多糖、黄花倒水莲多糖、商陆多糖、金线莲多糖、灵芝多糖、白花蛇舌草多糖、米糖多糖、芦荟多糖、山药多糖、大枣多糖等进行了较系统的含量研究。应用于临床取得较好疗效的有黄芪多糖、猪苓多糖、茯苓多糖、香菇多糖等。文献已有报道许多多糖对肝脏具有保护作用,并且它们的保肝作用多与免疫因素联系密切例如：虫草多糖对小鼠免疫性肝损伤的保护作用,天麻多糖GEP-2对BCG+LPS致小鼠免疫性肝损伤的保护作用,大蒜多糖C对免疫性肝损伤小鼠外周血淋巴细胞亚群的影响,紫菜多糖对肝损伤小鼠的保护作用,琐琐葡萄多糖对大鼠体外免疫性肝损伤保护作用的研究。丹参为唇形科植物丹参Salvia miltiorrhiza Bge.的干燥根及根茎,性味苦,微寒,归心、肝经。始载于《神农本草经》,列为草部上品,名为郄蝉草。为多年生直立草本,高40-80cm,全株密被黄白色柔毛及腺毛；根肉质,圆柱形,外皮朱红色。丹参具有活血祛瘀、通经止痛、清热安神的功效。其“善治血分,去滞生新,调经顺脉”之功效尤佳。故有“一味丹参,功同四物”之誉,广泛应用于临床。经现代研究证明,丹参有效化学成分为脂溶性菲醌色素丹参酮类(如：丹参酮ⅡA等)和一些水溶性的酚性化合物(如丹酚酸类、原儿茶醛等),水溶性和脂溶性成分均有药理活性。由于丹参及其复方制剂对许多疾病如冠心病、中风、肝炎、肿瘤、糖尿病等有良好的疗效,国内外对丹参化学成分、药理作用、临床应用、制剂、质量控制等方面进行了系统的研究,取得了显著的进展。本课题组在进行药物成分分离的实验中提取到了丹参中的多糖成分,经文献检索发现丹参中作为重要有效部位的多糖成分研究较少。现有文献报道的丹参多糖提取方法为水提醇沉法,其提取方法的缺点是操作复杂、多糖提取率较低,而且关于丹参多糖药效和药理方面的研究更少。本课题组进一步将丹参多糖的提取工艺进行优化,找到一种多糖提取率高、成本低廉、操作简单的提取方法。鉴于大多数多糖的疗效及丹参的临床应用,我们将对丹参多糖对免疫性肝损伤的影响及免疫调节机制进行初步研究,从而为其进一步研究开发奠定理论和实验基础。研究目的：通过对丹参多糖提取工艺、丹参多糖抗免疫性肝损伤及其免疫调节机制的实验研究,提供一种从丹参中提取多糖的方法并阐明其抗免疫性肝损伤及免疫调的作用机制,为丹参多糖的进一步开发利用奠定实验基础。研究方法：1.丹参多糖的提取1.1粉碎：将丹参粉碎至粒径为70～90μm的微粉。1.2脱脂：将丹参微粉用10倍体积的浓度大于或等于85%乙醇回流2小时,过滤,取滤渣挥干溶剂后备用。1.3酶处理：将脱脂处理后的丹参微粉加到水中,再加入酶,然后用碱将pH值调节至5.5,在70℃下保温1小时；所述的酶可以是纤维素酶、木瓜蛋白酶、果胶酶中的一种,用量为丹参重量1.5%,也可以纤维素酶、木瓜蛋白酶、果胶酶中的两种以上,每种酶的用量为丹参重量1%,最好是纤维素酶和木瓜蛋白酶,每种酶的用量均为丹参重量的1.5%。1.4超声提取：在频率为59kHz的超声波下处理,过滤,收集滤液,滤液浓缩至1：2(每2ml药液相当于1克药材)。1.5醇沉：加入70ml的乙醇使其在滤液中的浓度至85%,滤去乙醇即得丹参多糖粗品,再经洗涤得丹参多糖,75℃真空干燥。2.丹参多糖抗卡介苗(BCG)加脂多糖(LPS)诱导的小鼠免疫性肝损伤的实验研究2.1实验分组昆明小鼠,SPF级,体质量18～22g,60只(南方医科大学实验动物中心提供)。采用随机分组的方法分为正常组、模型组、丹参多糖高(360mg/kg)、中(180mg/kg)、低(90mg/kg)剂量组、联苯双酯组(200mg/kg),每组10只,雌雄各半。除正常组小鼠外,其余小鼠在造模的同时灌胃给药,灌胃剂量为0.5ml/20g,正常组小鼠给同等剂量生理盐水。2.2造模方法采用BCG加LPS诱导小鼠免疫性肝损伤。小鼠尾静脉注射BCG浆液0.2 ml/只(含菌量5×107单位),致敏后12 d,尾静脉注射LPS 0.2 ml/只(7.5μg)以诱导肝损伤,正常组小鼠尾静脉注射同等剂量生理盐水。2.3指标检测2.3.1摘眼球采血后,离心获取血清,按试剂盒说明操作检测血清ALT、AST、NO活性。2.3.2小鼠处死后,立即取出所需肝脏,称取0.25g肝组织用冷生理盐水洗去浮血,配成10%肝组织匀浆,匀浆液经500转离心20min去胞核碎片后,再经3000转离心15min,取上清液,ELISA方法检测TNF-a、IL-1β含量。2.3.3肝组织固定、切片和肝组织病变程度分级方法处死动物,取出肝脏,用冷生理盐水洗去浮血,拭干。于肝门处及右肝叶取材4块,每块大小约为1.5cm×1.5cm×0.4cm,立即用10%中性福尔马林固定。70%、80%、90%、95%、100%乙醇脱水,二甲苯透明,石蜡包埋,切片机作4μm切片,常规脱蜡,HE染色,中性树胶封片。用显微镜观察,以及PM-20型显微摄像系统照相。光镜下检查,按肝脏坏死程度分级:“-”,未见明显病理改变；“+”,部分肝组织肿胀伴有散在的点状坏死,汇管区有少许炎性细胞浸润；“++”,肝细胞肿胀有点状坏死及小灶性坏死,可见散在的肉芽肿形成,汇管区有大量炎性细胞浸润；“+++”,肝细胞肿胀,有大片状坏死,有肉芽肿形成,汇管区及周围有大量炎性细胞浸润。3.丹参多糖对免疫功能调节的机制研究3.1 BALB/c小鼠,SPF级,中山大学实验动物中心提供。分离BALB/c鼠脾细胞,不同浓度(1、10、50、100、200mg/l)丹参多糖对淋巴细胞(浓度1×106cell/ml)作用48h,MTT法检测细胞增殖。3.2分离B、T淋巴细胞,不同浓度(1、10、50、100、200mg/l)丹参多糖分别对B、T淋巴细胞(浓度1×106cell/ml)作用48h并与分裂素ConA(T细胞)、LPS(B细胞)(最终浓度5ug/ml)作比较,MTT法检测细胞增殖。3.3不同浓度(1、10、50、100、200mg/l)丹参多糖作用于T淋巴细胞72h,流式技术分析CD4+、CD8+的变化。3.4 200mg/l浓度丹参多糖作用于T细胞不同时间(12、24、48、72h),ELISA分析IL-2、IL-4浓度。3.5 200mg/l浓度丹参多糖作用于T细胞不同时间(24、48、72h),荧光定量PCR分析IL-2、IL-4水平变化。4.统计处理实验结果用均数(x)±标准差(s)表示,组间比较用one-way ANOVA。方差齐性时,采用LSD方法进行组间多重比较；方差不齐时,采用Welch法,组间多重比较采用DunnettT3方法进行。两组等级资料的比较采用两个独立样本的非参数检验Mann-WhitneyU法,多组等级资料的比较采用多个独立样本的非参数检验KrusKal-WallisH法,用统计软件SPSS13.0进行分析,以P<0.05定为差异有统计学意义。结果：1.采用粉碎、脱脂、酶处理、超声提取、醇沉的方法对丹参中的多糖成分进行提取,采用正交设计法进一步优化超声法的工艺条件,最终经统计学分析确定最优工艺条件为：以加水为12倍药材重量,粒度为过20目筛,超声提取时间20min为最佳提取条件。2.在丹参多糖抗免疫性肝损伤的实验中,血清ALT、AST水平丹参多糖高、中、低剂量组与模型组相比有显著差异(P=0.000,P=0.003,P=0.044)。阳性药对照组与模型组相比有显著差异(P=0.000)；血清NO和肝组织匀浆IL-1β、TNF-α的水平丹参多糖高剂量组与模型组相比有显著差异(P=0.000),丹参多糖中剂量组与模型组相比TNF-α、IL-1β有显著差异(P=0.048),但是NO差异不显著(P=0.057)。丹参多糖低剂量组与模型组相比TNF-α(P=0.187)、NO(P=0.097)、IL-1β(P=0.145)差异不显著。联苯双酯滴丸组与模型组相比NO有显著差异(P=0.037),但是TNF-a(P=0.064)、IL-1β(P=0.882)差异不显著；脏器系数丹参多糖高剂量组与模型组相比有显著差异(P=0.000,P=0.005,P=0.018)。丹参多糖中剂量组与模型组相比肝脏系数(P=0.043)、脾脏系数(P=0.016)有显著差异。丹参多糖低剂量组与模型组相比无显著差异(P=0.178,P=0.175,P=0.329)。阳性药物对照组与模型组相比除脾脏系数差异不显著外(P=0.059),其两项均有显著差异(P=0.000,P=0.042)；与正常组相比较,模型组肝脏病理变化显著(P=0.000)。丹参多糖高剂量组(P=0.032)、阳性药物对照组(P=0.016)与模型组相比肝脏病理变化显著。丹参多糖中剂量组(P=0.240)、丹参多糖低剂量组(P=0.547)与模型组相比肝脏病理变化不显著。3.在丹参多糖免疫调节机制的研究中,在10～200mg/l剂量范围内,丹参多糖不同剂量组均能显著促进脾细胞的增殖(P=0.000),与对照组比有显著性差异(P=0.020,P=0.000),丹参多糖200mg/l组显示出更高的活性；实验结果显示在100～200mg/l剂量范围内,丹参多糖组能显著促进T淋巴细胞的增殖,与对照组比较有显著性差异(P=0.042,P=0.000),同时丝裂原ConA与对照组比较有显著性差异(P=0.000)。丹参多糖浓度在50～200mg/l范围内,丹参多糖组能显著促进B淋巴细胞的增殖,与对照组比较有显著性差异(P=0.033,P=0.000),同时丝裂原LPS与对照组比较有显著性差异(P=0.000)；用200mg/l浓度的丹参多糖对小鼠淋巴细胞干预12h、24h、48h、72h后,IL-2水平升高,各时间段之间比较具有显著差别(P=0.000)。IL-4水平也有显著增强,各时间段之间比较具有显著差别(P=0.005),但是升高趋势较IL-2水平平缓；荧光定量PCR检测结果显示,经浓度为200mg/l的丹参多糖干预24h、48h、72h后IL-2 mRNA和IL-4 mRNA表达存在差异(P=0.016,P=0.169)；与空白对照相比,干预72h后IL-2 mRNA和IL-4mRNA表达均有所有提高,差异有统计学意义(P=0.022,P=0.036)；干预24h、48h后的IL-2mRNA和IL-4 mRNA表达差异不显著(P=0.753,P=0.400,P=0.177,P=0.208)。说明丹参多糖在干预72h后可有效增强IL-2 mRNA和IL-4 mRNA的表达；丹参多糖在1～200 mg/l剂量范围内,随着剂量的升高对CD4+、CD8+比例的影响逐渐增强,显示出明显的剂量依赖性,同时与对照组比较较高浓度组差异有统计学意义(P=0.028,P=0.007,P=0.008,P=0.027,P=0.000)。结论：1.确定最优丹参多糖提取工艺条件为：以加水为12倍药材重量,粒度为过20目筛,超声提取时间20min为最佳提取条件,本提取方法具有低耗能、提取率高、操作简单等优点。2.结果显示丹参多糖有抗免疫性肝损伤的作用,这种作用的实现不仅表现在直接的保肝降酶方面,还对肝损伤后小鼠的免疫功能起到调节作用,通过免疫功能的调控进一步发挥保肝降酶作用。3.体外实验说明丹参多糖在一定浓度范围内对淋巴细胞有较强的增殖作用,并且还有促进相关细胞因子表达及分泌的作用,与体内试验的结果相一致,进一步说明丹参多糖在免疫调节方面有很好的疗效。