目的Numb是重要的细胞命运决定子,在决定人胚胎干细胞的分裂方式中起重要作用。本实验用含有人Numb基因的慢病毒,感染人胚胎干细胞,建立人Numb基因过表达的人胚胎干细胞系,为进一步研究人Numb基因调控干细胞“干性”的研究提供实验素材。方法1、采用本实验室之前成功构建的Lenti-EF1a-rtTA-IRES-puro慢病毒载体感染hESC,经药选后建立含有调控组分的细胞系。再将Lenti-EF1a-rtTA-IRES-EGFP慢病毒载体感染rtTA过表达胚胎干细胞,从而构建完整的四环素调控人Numb过表达的hESCs细胞系。2、采用本实验室之前构建的Lenti-EF1a-rtTA-IRES-EGFP慢病毒载体感染hESCs,建立EGFP过表达细胞系。根据EGFP所发的绿色荧光挑取Numb过表达的hESC克隆并纯化,提取纯化后的细胞的DNA,通过RT-PCR检测Numb是否成功整合至hESC。并使用DOX诱导后通过Q-PCR检测Numb的表达量。结果(1)成功建立人Numb基因过表达的人胚胎干细胞系,荧光显微镜下可见发绿色荧光克隆。(2)通过RT-PCR检测人Numb基因过表达的人胚胎干细胞系的NumbDNA,结果显示23号和44号克隆在Maker的Numb基因分子大小处有明显条带。(3)比较DOX诱导组(实验组)和未加DOX诱导组(CON组/对照组)的23号和44号克隆的Numb的表达。Q-PCR结果示可见第23号克隆DOX组Numb表达量为CON组的4.35±0.22倍,第44号DOX组Numb表达量为CON组的4.71±0.13倍。(P<0.05)。结论本实验成功完成了Numb基因过表达的人胚胎干细胞系的构建和论证。