目的:机体感染人类免疫缺陷病毒（Human Immunodeficiency Virus,HIV）后病毒持续复制导致靶细胞耗竭,最终发展为艾滋病（Acquired Immunodeficiency Syndrome,AIDS）,严重危害人类健康。病毒的生物学特性和宿主的遗传、免疫学特征等多种因素共同作用导致HIV感染者疾病进展呈现不同结局。病毒与宿主之间究竟发生了怎样的作用,哪些因素影响感染者的预后和结局,至今尚无定论。研究提示感染早期（原发感染）病毒与宿主的相互作用对于疾病结局有重要影响,阐明HIV感染早期影响疾病进展的相关因素将为HIV疫苗研发和防控策略制定提供关键靶标。目前研究关于HIV感染早期影响疾病进展因素的研究多数局限于病毒本身的因素或宿主的免疫功能,缺乏对病毒和宿主之间相互作用的综合性研究。目前对感染早期HIV原代分离株的生物学特性研究较少。HIV病毒分离株的细胞嗜性和病毒复制能力是HIV生物学特性的两个重要方面。病毒嗜性的分布和变化规律与病毒亚型密切相关,国际上对我国目前主要流行的CRF01_AE亚型病毒报道较少,且集中于基因型预测方法,亟待通过病毒表型明确CRF01_AE亚型病毒的嗜性特征;除了个别病例提示感染缺陷病毒可能导致疾病长期不进展外,感染早期病毒复制能力是否影响HIV感染疾病进展尚不明确。CD8⁺T细胞在抗病毒感染适应性免疫应答中发挥核心作用。既往研究关于CD8⁺T细胞应答与疾病进展相关性的结论主要来自于个别毒株体外感染易感细胞系的经验或者评价CD8⁺T细胞产生效应分子能力的实验方法,近年来研究提示上述方法不能全面反映CD8⁺T细胞应答有效性,其与HIV感染疾病进展的关系也无明确结论。选用有效的评价体系研究感染早期CD8⁺T细胞应答,明确其与疾病进展的相关性十分必要。CD8⁺T细胞发挥作用的“终极效应功能”（ultimate effector function）是清除HIV感染细胞、抑制HIV复制,Asier Sáez-Cirión等人研发了应用HIV感染者病毒原代分离株体外评价特异性CD8⁺T细胞应答的方法,可以准确评价CD8⁺T细胞杀伤HIV感染细胞、抑制HIV复制的“终极效应功能”。HIV病毒的生物学特性与疾病进展密切相关,研究CD8⁺T细胞应答对疾病进展的影响时须结合病毒本身的特性,本研究引入HIV感染者自体病毒分离株,将能够更加准确地评价CD8⁺T细胞应答。T细胞耗竭是病毒感染慢性期难以控制病毒血症的重要原因之一。CD8⁺T细胞功能耗竭的发生与其控制病毒复制的关系尚不明确,特别是感染早期。多功能性T细胞（polyfunctional T cells）是近年来免疫学研究的热点。研究显示在HIV感染慢性期,具有多种效应功能的CD8⁺T细胞与延缓HIV疾病进展相关。在HIV感染早期,功能表型与慢性期可能存在差异。目前,CD8⁺T细胞的不同功能特征与其控制病毒能力之间的关联尚无定论。近年男男性接触（Men who have sex with man,MSM）是我国HIV防控工作关注的重点人群。本研究通过前瞻性高危MSM队列,对辽宁地区原发感染MSM进行动态随访,检测不同疾病进展者病毒原代分离株的复制动力和嗜性,以阐明感染早期病毒生物学特性与HIV原发感染者疾病进展的相关性;引入HIV原发感染者自体病毒分离株,以HIV感染者自体CD4⁺T细胞作为靶细胞,准确、全面地评价CD8⁺T细胞抑制自体病毒复制的“终极效应功能”,明确其与疾病进展的相关性;测定与“终极效应功能”相关的耗竭相关抑制性受体PD-1表达和胞内细胞因子、增殖、脱颗粒等多种功能表型,以明确与CD8⁺T细胞抑制自体病毒复制能力相关的功能特征,为艾滋病疫苗研制和防控方案制定提供重要基础。材料与方法:中国医科大学艾滋病研究所HIV高危MSM,于2008年-2012年诊断为原发感染者后进入长期随访的前瞻性队列。根据Fiebig分期,结合流行病学资料与实验室检测结果估计感染时间（days post infection,DPI）。选取自愿参加随访、估计感染时间在180天内的原发感染者进入队列。病毒分离获得高滴度病毒分离株,检测嗜性表型和病毒复制能力;血浆病毒单基因组PCR扩增,采用Geno2pheno、PSSMx4r5、PSSMsinsi和11/25规则结合净电荷数方法预测嗜性基因型。已获得感染早期高滴度原代分离株,且已分离并冻存与分离株同期采血的外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell,PBMC）的原发感染者进行CD8⁺T细胞体外抑制自体病毒试验以及细胞功能表型与自体病毒抑制率相关性研究。分选原发感染者CD8⁺T细胞作为效应细胞,以自体病毒分离株感染CD4⁺T细胞（靶细胞）,评价CD8⁺T细胞对自体病毒复制产生p24的抑制率。收集特异性CD8⁺T细胞抑制自体病毒实验染毒后第4天的细胞,流式检测CD8⁺T细胞表面PD-1、HLA-DR、CD107a和细胞内Ki-67、IFNγ和TNFα。采用GraphPad Prism 5软件绘制复制动力曲线图,计算p24抗原峰值及曲线下面积。采用SPSS 17软件统计分析。数据用中位数±标准差表示,线性混合模型评估CD4⁺细胞下降速率。Kaplan-Meier生存分析比较CD8⁺T细胞对自体病毒抑制能力高、低两组间CD4⁺T细胞水平下降到350cells/μL的时间。应用Spearman相关分析CD8⁺T细胞对自体病毒复制的抑制率与病毒载量、CD4⁺T细胞数量之间的关系。应用Spearman相关分析CD8⁺T细胞对自体病毒复制的抑制率与分泌IFNγ、TNFα等细胞因子胞内表达、增殖、脱颗粒功能及功能耗竭相关标志物表达的关系。统计概率采用双侧检验,p<0.05时有统计学意义。实验结果:1、病毒分离根据入选标准,59名原发感染者进入本研究。以汉族CRF01_AE亚型感染MSM为主,进入队列的中位时间是感染后31天（IQR:25-59）。中位随访时间为3.2年（IQR1.9-4.4）,累计随访188.2人年。59例原发感染者中高达45例（76.3%）CD4细胞计数在随访过程中下降到350 cells/μL以下,下降中位时间为0.6年（IQR 0.2-2.7）。线性混合模型显示CD4细胞下降的斜率为-0.10√CD4/月。结果显示我国东北CRF01_AE亚型感染MSM人群HIV感染呈现快速疾病进展。2、病毒嗜性与疾病进展相关性。59例感染者中共获得458条SGA序列（包括本室前期获得的31条序列）,用Geno2pheno（FPR=10%,5%,2%）、PSSMx4r5、PSSMsinsi和11/25联合净电荷规则预测R5病毒数量分别为360（78.8%）、412（89.9%）、442（96.5%）、442（96.5%）、446（97.4%）和450（98.2%）。59例感染者中,Geno2pheno（FPR=10%,5%,2%）预测仅携带R5病毒的感染者分别为41、51、55例（69.5%,86.4%,93.5%）,另外3种算法预测的结果分别为54、57、56例（91.5%,96.6%,95.0%）。原发感染者获得49株病毒原代分离株,嗜性表型检测48例为R5病毒（98.0%）,仅1例为X4/DM毒株（2.0%）。基因型和表型的结果提示在CRF01_AE亚型原发感染MSM中,主要流行R5毒株。原发感染者随访检测嗜性表型,生存分析结果显示感染后第1年7.9%感染者发生嗜性转换,92.1%感染者主要携带R5毒株。然而,到感染第2年,发生转换的人数上升到32.8%,感染后第3年39.5%发生嗜性转换。用感染3年内嗜性是否转换为X4/DM将原发感染者分为转换组和未转换组,线性混合模型表明转换组CD4⁺T细胞数量下降速率显著高于未转换组（P<0.001）,校正年龄、基线CD4⁺T细胞水平等因素后,差异仍然显著。在转换组感染者中去除转换前的CD4⁺T细胞计数,在未转换组感染者中,去除感染482天（发生嗜性转换的中位感染时间）以前的CD4⁺T细胞计数;转换组CD4⁺T细胞计数变化速率为每月下降10细胞/μL/月（IQR:1.8-19.6）,未转换组速率为每月下降5细胞/μL/月（IQR:3.2-6.3）。线性混合模型结果显示转换组CD4⁺T细胞计数下降速率显著高于未转换组（P=0.003）。我们的数据显示感染后3年内发生嗜性转换与原发感染MSM的CD4⁺T细胞快速下降密切相关。3、原发感染者病毒复制能力与疾病进展的相关性。复制动力曲线图显示病毒原代分离株体外复制p24浓度主要呈现逐渐增高（day5-day15）、平台（day15-day22）、下降（day22-day31）的动态变化过程;到达峰值的中位时间为19天（IQR:15-22天）,中位峰值为5.50log10pg/mL（IQR:5.45-5.56log10pg/mL）,中位曲线下面积（AUC）为6.63 log10pg/mL·day（IQR:6.54-6.73 log10pg/mL·day）。根据19天内病毒复制AUC高低将原发感染者分为2组。线性混合模型显示2组原发感染者CD4⁺T细胞下降的速率没有显著差异（P>0.05）。4、HIV原发感染者CD8⁺T细胞抑制自体病毒能力与疾病进展相关HIV原发感染者CD8⁺T细胞对自体病毒复制的抑制率与CD4绝对计数显著正相关（r=0.762,p=0.004）,与病毒载量存在负相关趋势（p=0.894）。根据CD8⁺T细胞抑制自体病毒能力高低将原发感染者分为2组,线性混合模型结果显示抑制能力低组CD4⁺T细胞计数下降速率显著高于抑制能力高组（P=0.001）。Kaplan-Meier生存分析结果显示,抑制能力低组CD4⁺T细胞绝对计数下降到350cells/μl的平均时间为272±93天（95%CI,90-454天）,短于抑制能力高的原发感染者CD4⁺T细胞绝对计数下降到350cells/μl的平均时间为1042±36天（95%CI,972-1112天）（log rankχ2=11.46,p=0.001）。我们的数据显示原发感染者CD8⁺T细胞抑制自体病毒能力与控制CD4⁺T细胞快速下降相关。5、原发感染者HIV特异性CD8⁺T细胞功能耗竭标志物表达Spearman相关分析发现原发感染者表达PD-1的CD8⁺T细胞百分数与CD8⁺T细胞对自体病毒复制抑制率显著负相关（r=-0.748,p=0.005）,表达PD-1的CD8⁺T细胞百分数与CD4⁺T细胞绝对计数显著负相关（r=-0.72,p=0.008）,与病毒载量存在正相关趋势（p=0.247）。6、原发感染者HIV特异性CD8⁺T细胞多种效应功能Spearman相关分析发现原发感染者分泌细胞因子IFNγ和TNFα的CD8⁺T细胞百分数与CD8⁺T细胞对自体病毒复制的抑制率有正相关趋势（p>0.05）。表达增殖相关分子Ki-67的CD8⁺T细胞百分数与对自体病毒复制的抑制率之间有正相关趋势（p>0.05）,表达HLA-DR的CD8⁺T细胞百分数与对自体病毒复制的抑制率之间有负相关趋势（p>0.05）,表达脱颗粒功能相关分子CD107a的CD8⁺T细胞百分数与CD8⁺T细胞对自体病毒复制的抑制率之间有正相关趋势（p=0.106）。等可能不是HIV感染早期CD8⁺T细胞抑制病毒复制的唯一途径。结论:我国CRF01_AE感染MSM中主要流行R5病毒。在感染3年内,近40%CRF01_AE感染者发生病毒嗜性转换,与CRF01_AE感染者CD4^+T细胞计数快速下降密切相关。HIV原发感染者存在能够抑制自体病毒复制的特异性CD8⁺T细胞应答。感染早期CD8⁺T细胞自体病毒抑制率与疾病进展相关。CD8⁺T细胞PD-1表达与抑制自体病毒复制能力负相关,提示感染早期PD-1介导的CD8⁺T细胞耗竭可能是疾病进展的影响因素。