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目的十溴联苯醚(decabromodiphenyl ether,BDE-209)是多溴联苯醚(Polybrominated diphenyl ethers,PBDEs)的一种同系物,添加到日常产品用作阻燃剂,通过暴露途径进入人体后可蓄积在肝脏、甲状腺等器官中,可导致发育神经毒性和内分泌紊乱,BDE-209作为一种内分泌干扰物还会影响雄性生殖健康,但是BDE-209暴露影响睾丸精子发生的机制尚未探明。本研究为了探讨雌激素受体(Estrogen Receptor,ER)α在BDE-209暴露致睾丸生殖障碍中的可能作用机制,了解BDE-209致生殖损伤的损伤细胞类型以及发生阶段。方法24只雄性成年SD大鼠,随机分成DMSO溶剂对照组、0.1 mg/kg BW BDE-209组、0.5 mg/kg BW BDE-209组和2.5 mg/kg BW BDE-209组,建立BDE-209经睾丸暴露SD雄性大鼠模型。经过一个大鼠生精周期后,收集生物材料,称量睾丸、附睾和生殖腺的重量,计算脏器系数;透射电镜分析精子染色质浓缩情况;精子涂片观察精子一般形态改变;睾丸固定后制作石蜡切片,HE和PAS染色检测睾丸组织形态改变;免疫荧光检测各组中睾丸ERα、生殖细胞相关指标PLZF、c Kit、Sox9和Wnt指标Wnt3a、Wnt5a的蛋白荧光表达水平变化;蛋白免疫印迹(Western Blot,WB)检测各组中睾丸ERα、生殖细胞相关指标PLZF、c Kit、Sox9和Wnt相关指标Wnt3a、Wnt5a以及BRDT、GSK-3β的蛋白表达水平变化。另外24只雄性成年SD大鼠,随机分成DMSO组、BDE-209组、丙基吡唑苯酚(4,4’,4’’-(4-propyl-[1h]-pyrazole-1,3,5-triyl)trisphenol,PPT)组和BDE-209+PPT联合组,建立BDE-209经睾丸暴露SD雄性大鼠模型,BDE-209+PPT联合组睾丸内注射BDE-209和PPT混合液。经过一个大鼠生精周期后,收集生物材料,称量睾丸、附睾和生殖腺的重量,计算脏器系数;苯胺蓝染色观察附睾尾部精子染色质状态;分离睾丸制备石蜡切片,进行HE和PAS染色观察各组睾丸形态学变化;免疫荧光检测各组睾丸中ERα、生殖细胞相关指标PLZF、c Kit、Sox9和Wnt相关指标Wnt3a、Wnt5a的蛋白表达水平变化;WB检测各组睾丸中ERα、生殖细胞相关标记蛋白PLZF、c Kit、Sox9和Wnt相关指标Wnt3a、Wnt5a以及BRDT、GSK-3β的表达水平变化;q RT-PCR检测各组睾丸中ERα、PLZF、c Kit、Sox9、Wnt3a、Wnt5a m RNA的变化。结果(1)BDE-209能引起SD雄性大鼠产生生殖毒性。与DMSO溶剂对照组相比,BDE-209各剂量组睾丸都出现不同程度的萎缩,睾丸系数减小,精子计数减少,染色质浓缩受损。HE和PAS染色发现曲细精管发现不同程度的损伤,管腔内出现未成熟生精细胞脱落,提示精原细胞受损严重,且损伤有随BDE-209剂量增大而加重的趋势。(2)BDE-209下调SD雄性大鼠睾丸ERα表达,引起精原细胞组织形态学损伤,精原细胞标记蛋白表达减少。WB结果显示相比于DMSO溶剂对照组,各剂量组睾丸ERα蛋白表达下降(P<0.05),免疫荧光结果与WB表达一致。曲细精管内受到损伤的是精原细胞而非支持细胞,WB检测精原细胞相关标志物PLZF、c Kit蛋白表达,发现与DMSO溶剂对照组相比,各剂量组PLZF表达减少(P<0.05),c Kit在各组间表达无明显差异,2.5 mg/kg BW BDE-209组支持细胞标记Sox9表达升高(P<0.05)。免疫荧光结果发现相比于DMSO溶剂对照组,各剂量组中PLZF,c Kit蛋白荧光表达明显减少,Sox9表达略有上升。(3)BDE-209染毒引起了睾丸内Wnt信号的改变。WB结果显示相比于DMSO溶剂对照组,0.1 mg/kg和0.5 mg/kg BW BDE-209组大鼠睾丸Wnt3a蛋白表达水平升高(P<0.05),0.5 mg/kg和2.5 mg/kg BW BDE-209组大鼠睾丸Wnt5a蛋白表达水平升高(P<0.05),2.5 mg/kg BW BDE-209组大鼠睾丸GSK-3β蛋白表达水平增加(P<0.05)。免疫荧光结果显示,相比于DMSO溶剂对照组,0.5 mg/kg BW BDE-209组大鼠睾丸Wnt3a与Wnt5a表达均明显上升,2.5 mg/kg BW BDE-209组Wnt3a表达明显上升。(4)PPT上调SD雄鼠睾丸中的ERα后,缓解了BDE-209所致的精原细胞损伤,减轻了睾丸系数下降、精子计数下降和染色质浓缩受损程度。PPT和BDE-209共处理后,大鼠睾丸中的ERα蛋白和m RNA水平有明显的上升(P<0.05),大鼠睾丸曲细精管的组织结构损伤有所恢复,HE和PAS染色未见明显的生精细胞坏死。与BDE-209组相比,BDE-209+PPT联合组睾丸中PLZF、c Kit蛋白表达增加(P<0.05),q RT-PCR结果显示,与BDE-209组相比,BDE-209+PPT联合组睾丸中PLZF m RNA表达明显上升(P<0.05)。(5)上调ERα后睾丸内Wnt信号改变被抑制。与BDE-209组相比,BDE-209+PPT联合组睾丸中Wnt相关指标Wnt3a、Wnt5a蛋白和m RNA水平均有不同程度的减低(P<0.05)。结论(1)BDE-209引起SD雄鼠睾丸ERα下调及Wnt信号改变,并导致生殖毒性,引起精子发生过程中的精原细胞受损。(2)ERα激动剂PPT和BDE-209共处理后缓解了SD雄鼠睾丸中ERα下调及Wnt信号改变,缓解了BDE-209引起的生殖毒性效应,减轻了精原细胞受损程度。