论文部分内容阅读
由于许多化学合成药物的较强的毒副作用,人们越来越重视从天然提取物中开发毒副作用较小的抗炎药物,寻求安全有效的抗炎提取物,是防治该类疾病的新思路,也是新型抗炎饲料添加剂开发的新热点。本试验以LPS诱导的炎症反应调节信号通路为主线,研究栀子对炎症应激仔猪炎症通路及细胞因子水平变化的影响,体外建立仔猪肠上皮细胞应激模型,研究栀子提取物京尼平苷对猪肠上皮细胞炎症通路、紧密连接等水平的影响,为预防仔猪免疫应激及各种肠道疾病提供新思路。体内试验部分选取24头体重相近断奶仔猪随机分为四组,每组6头,预饲3天,3个栀子添加组每头每天在基础日粮中分别添加栀子粉1.25、2.5、5 g,自由饮水,采食,第10天称重,前腔静脉采血后注射LPS,并在注射后3h、24 h采血。分离血清和淋巴细胞。测定淋巴细胞中NF-κB通路和IAP蛋白表达量、mRNA相对表达量和血清中8种细胞因子的变化水平。体外试验部分将IPEC-J2细胞以合适浓度细胞液进行铺板,分别为空白组,模型组,0.1、1、10 mmol/L浓度京尼平苷添加组,37℃、5%CO2培养箱24 h,除对照组外每孔加入20μL0.1 mg/mL的LPS作用6 h,收取细胞并检测NF-κB通路和紧密连接蛋白水平及相关mRNA相对表达量。试验结果如下:仔猪实验部分:(1)生长性能变化:栀子添加组断奶仔猪日增重和日采食量显著降低(P<0.05),低、中剂量栀子添加组料重比升高不显著(P>0.05)。(2)蛋白变化水平:致炎前后栀子添加组p65、IκB磷酸化水平均有显著下降(P<0.05),低中剂量栀子添加组IAP蛋白表达水平显著低于炎症对照组(P<0.05);致炎前,低剂量组p65和IκB蛋白表达量低于炎症对照组(P<0.05),致炎后3 h和24 h,低剂量组IκB蛋白表达量低于炎症对照组(P<0.05)。(3)mRNA相对表达量变化:低中剂量组NF-κB p65显著低于炎症对照组(P<0.05);中高剂量组IκB和IKK显著低于炎症对照组(P<0.05);低高剂量组COX-2显著低于炎症对照组(P<0.05);低中剂量组IAP显著低于炎症对照组(P<0.05)。(4)血清中细胞因子变化水平:与非致炎组对比,LPS致炎后,IL-1β、IL-10、IFN-γ的含量显著上升(P<0.05)。在致炎情况下,低剂量栀子添加组在致炎3 h时IL-1β与TNF-α显著低于炎症对照组(P<0.05),24 h时IL-10显著高于对照组(P<0.05),IFN-γ和TNF-α显著降低(P<0.05);中剂量添加组在致炎后3 h和24 h时IL-1β、TNF-α显著降低(P<0.05),IL-4、IL-10显著上升(P<0.05);高剂量添加组在3 h和24 h时IL-1b、IL-6、IL-8、IL-12和IFN-γ含量较对照组显著降低(P<0.05),IL-4、IL-10显著上升(P<0.05),在24 h时TNF-α的含量较对照组显著降低(P<0.05)。体外细胞实验部分:(1)蛋白变化水平:模型组和低中浓度添加组IKK显著高于对照组(P<0.05),炎症模型组p65及IKK磷酸化程度均显著提高(P<0.05),高浓度京尼平苷能够显著降低细胞中磷酸化p65蛋白表达水平(P<0.05),其余各试验组p65和IKK磷酸化恢复至正常水平;三种紧密连接蛋白在LPS刺激后均显著低于对照组(P<0.05),药物添加组OCCLUDIN蛋白表达量显著高于对照组(P<0.05),中、高浓度药物添加组ZO-1蛋白表达量显著高于对照组(P<0.05),中浓度药物添加组三种紧密连接蛋白均显著提升(P<0.05)。(2)mRNA相对表达量变化:LPS致炎组p65、IKK、IκB mRNA相对表达量显著高于对照组(P<0.05),低浓度组p65、IKK显著高于对照组(P<0.05),高浓度组IκB显著低于对照组(P<0.05);致炎组COX-2显著高于对照组(P<0.01),三个药物添加组有明显恢复作用,中、高浓度组COX-2显著高于对照组(P<0.05);致炎组ZO-1、CLAUDIN-1显著低于对照组(P<0.05),低浓度组紧密连接均恢复至正常水平。结论:1、三个栀子添加组均能降低炎症反应中炎症通路因子的增加,缓解炎症反应对促炎和抑炎细胞因子的改变,从而改善LPS对断奶仔猪的免疫应激情况。2、通过京尼平苷的干预作用,降低了IPEC-J2细胞中炎症通路蛋白的表达和mRNA相对表达量,将COX-2mRNA相对表达量恢复至正常水平,提高紧密连接蛋白的表达和mRNA相对表达量。说明添加京尼平苷可以缓解炎症,提高细胞紧密连接水平。