论文部分内容阅读
因外伤、感染、肿瘤等原因造成的骺板损伤是儿童特有的常见疾病,损伤后出现骺板部分早闭,严重者将导致患儿肢体短缩及成角畸形。目前,临床上主要采用切除骨桥,填充脂肪、骨水泥或骨蜡等方法治疗骺板早闭。随着组织工程学的发展,组织工程化骺板细胞广泛应用于骺板损伤模型,并取得了一定实验效果。然而,同种异体骺板细胞的抗原性限制其临床应用。本研究应用APA微囊包裹同种异体骺板细胞以减少机体免疫排斥反应,同时通过释放TGF-β1诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞方向分化,以达到修复骺板损伤的目的。目的:建立骺板细胞的体外分离、培养及冻存的实验方法;制备APA微囊化骺板细胞,并观察其对骨髓间充质干细胞的诱导分化作用;将APA微.囊化骺板细胞植入骺板缺损区,观察其能否阻止骨桥形成、延长骺板开放时间及恢复肢体的纵向生长能力。方法:(1)体外分离、培养幼兔股骨远端及胫骨近端的骺板细胞;并进行甲苯胺蓝、番红“0”及Ⅱ型胶原免疫组织化学染色,鉴别骺板细胞在体外培养时的生物学表型;通过ELISA方法检测骺板细胞对TGF-β1等细胞因子的分泌情况。(2)制备APA微囊化骺板细胞,并检测微囊内骺板细胞对TGF-β1的释放情况;将微囊化骺板细胞与BMSCs共培养,观察诱导后的BMSCs是否具备软骨细胞的生物学表型。(3)构建幼兔股骨远端骺板损伤模型,随机分为4组,分别将APA微囊化骺板细胞、APA空白微囊及骺板细胞植入缺损模型,并设置空白组作为对照。术后进行双下肢X线片检查对比观察双侧股骨短缩及成角畸形情况,在4、8、12、16周各组分别取材、染色,观察骺板缺损部分的修复情况。结果:(1)通过体外分离方法获得大量具备良好生物学活性的骺板细胞,CCK-8生长曲线显示骺板细胞在体外培养时增殖情况良好;组织化学染色证实其具有正常的骺板细胞表型。(2)骺板细胞在微囊凝胶中培养时,生长、增殖情况良好,并向细胞周围分泌糖胺聚糖及Ⅱ型胶原等细胞外基质,而且通过微囊膜释放TGF-β1诱导BMSCs向软骨细胞方向分化。(3)微囊化骺板细胞植入组显示在缺损部位可见柱状结构的骺板样细胞以及类软骨陷窝样结构,在缺损区周围有大量微囊化细胞,呈圆球形,形态完整,微囊内可见存活的骺板细胞。X线片显示肢体出现轻度短缩及成角畸形,其程度均小于其余组别(P<0.05)。空白微囊组显示骺板缺损充满微囊和骨小梁结构。骺板细胞植入组可见少量散在的骺板细胞,周围出现淋巴细胞炎症反应。空白组缺损区域可见结缔组织和血管,缺损空腔塌陷形成骨桥。结论:本实验结果显示APA微囊复合同种异体骺板细胞填充骺板缺损后,微囊内的骺板细胞可以存活并释放TGF-β1,能够诱导髓腔中的BMSCs向软骨细胞分化,使骺板开放时间延长,减少了肢体短缩及成角畸形。另外,APA微囊以其良好的免疫隔离作用,可以有效地防止机体对同种异体细胞产生免疫排斥反应。