阿尔兹海默症(Alzheimer’s disease,AD)是发生在老年期及老年前期的一种慢性退化性脑变疾病,以进行性记忆减退、认知障碍、人格改变为临床表现。在人口老龄化的当代社会,AD成为继心脑血管疾病,肿瘤和脑卒中的第四大杀手,威胁着老年人身体健康,降低了生活质量,加重家庭和社会负担。AD发病原因复杂多样,目前具体发病机制仍不明确。近年研究发现,神经炎症反应是AD的一个重要的致病原因。AD患者脑内小胶质细胞(Microglia,MG)高度活化,炎性因子含量增高。作为神经炎性的始作俑者,MG免疫功能的调控成为AD治疗的新靶点,其免疫功能的研究也跻身于神经退行性疾病领域的研究热点。MG在CNS中的作用是把双刃剑,激活的MG吞噬细胞残渣,通过抗原递呈功能、细胞因子分泌参与免疫应答反应,移除病原体。然而,MG过度激活导致CNS发生慢性炎症,加重大脑损伤。因此,严格调控MG免疫反应是防止神经炎性发生的关键。乙酰胆碱是一类参与中枢大脑学习、认知、记忆等的重要神经递质,乙酰胆碱作用的受体包括毒蕈碱型胆碱受体(Muscarinic acetylcholine receptors,mAChRs)和烟碱型胆碱受体(Nicotinic acetylcholine receptor,nAChRs)。近年来研究表明,乙酰胆碱系统中nAChRs在MG介导的神经炎性发挥作用,а7烟碱型受体(а7nAChR)在MG表达,激活а7nAChR抑制MG的炎性反应。然而,mAChRs在MG的表达情况以及是否参与MG的炎性调控尚不清楚。本实验室前期研究发现,SD大鼠长期腹腔注射m AChRs非选择性拮抗剂盐酸苯海索(Trihexyphenidyl hydrochloride,THP)促进大脑海马和皮层的MG增生和激活,上调MG的CD68表达同时伴随M1受体表达增加,并且两者存在共定位,暗示M受体介导THP对MG活化的调控作用。在本研究中,我们将首次确证mAChRs在MG的表达情况,并且观察mAChRs对MG免疫应答功能的调控作用。本研究的开展利于探讨m AChRs与神经炎性的关系,开拓了其影响AD发展的新机制研究,有利于寻找治疗AD的新靶点。我们首先建立原代大鼠皮层小胶质细胞培养方法,在体外条件下,确证mAChRs在小胶质细胞表达情况;利用mAChRs非选择性激动剂氧化震颤素(Oxotremorine,OX)、mAChRs非选择拮抗剂阿托品和M1受体阻断剂毒蕈碱毒素7(Muscarinic Toxin 7,MT7)三种工具药,研究mAChRs对小胶质细胞抗原递呈功能、小胶质细胞活化和免疫炎症介质释放的调控作用。方法:(1)建立大鼠皮层原代小胶质细胞培养方法:将出生12 h内的SD大鼠的皮层神经胶质细胞混合培养8-9天,小胶质细胞分层明显且数量达到最多,利用胰酶温和消化法和震摇法进行小胶质细胞分离纯化;纯化的小胶质细胞培养3天后基本恢复静息状态,通过小胶质细胞标记分子Iba1免疫荧光染色进行鉴定。(2)mAChRs在小胶质细胞表达研究:利用RT-PCR、Western-blot技术从mRNA和蛋白水平检测mAChRs在小胶质细胞表达情况。(3)mAChRs对小胶质细胞抗原递呈功能影响研究:mAChRs非选择性激动剂OX处理小胶质细胞,利用激光共聚焦扫描显微镜(Confocal laser scanning microscope,CLSM)结合免疫荧光、流式细胞术观察OX对主要组织相容性抗原分子Ι(Major Histocompatibility ComplexΙ,MHCΙ)表达影响;荧光定量PCR检测OX对小胶质细胞抗原递呈分子相关基因Rt1-Aw2、β2m和Tap1 mRNA表达影响。(4)M1受体参与mAChRs调控小胶质细胞抗原递呈作用研究:利用M1受体阻断剂MT7,应用免疫荧光结合CLSM、Western-blot和荧光定量PCR检测MT7对小胶质细胞MHCΙ分子和M1受体表达的变化。(5)mAChRs对小胶质细胞活化的影响:免疫荧光结合CLSM和Western-blot检测OX单独给药以及MT7和OX伴随给药对小胶质细胞激活分子CD68和CD11b表达影响。(6)mAChRs对小胶质细胞炎症介质释放影响:Luminex技术检测OX对小胶质细胞IL-1β、TNF-а和IL-10释放的影响。结果:(1)改进了原代小胶质细胞的培养方法,小胶质细胞Iba1阳性率高达95%;观察了小胶质细胞生长规律,神经胶质细胞混合培养时小胶质细胞呈现阿米巴样,分离纯化3天后基本恢复分枝状;(2)RT-PCR结果表明,m AChRs五种亚型受体mRNA均在小胶质细胞表达,免疫荧光结合CLSM分析和Western-blot结果显示M1受体表达于小胶质细胞,并且定位在胞膜和胞浆;(3)免疫荧光结合CLSM分析发现,正常组小胶质细胞MHCΙ表达量较少,OX(10-5M)与小胶质细胞共同孵育72 h,MHCΙ表达显著上调(P<0.001);(4)流式细胞术结果表明,正常组小胶质细胞膜共标记MHCΙ和β2m的细胞阳性率为8.46±0.47%,OX组β2m和MHCΙ共标记细胞阳性率为51.80±1.48%,与正常组比较,OX组显著增加了5倍(P<0.001),表明OX促进小胶质细胞膜功能性MHCΙ表达;(5)荧光定量PCR结果发现,OX促进抗原递呈分子相关基因Rt1-Aw2、β2m和Tap1 mRNA表达(P<0.001);(6)免疫荧光结合CLSM分析表明,OX(10-5M,40 min)同时上调小胶质细胞MHCΙ和M1受体表达(P<0.001),MT7(10-8 M)预处理小胶质5 min,部分阻断OX诱导的MHCΙ和M1受体表达(P<0.001);并且M1受体与MHCΙ存在共定位,提示M1受体参与OX上调MHCΙ表达;(7)OX动态影响小胶质细胞M1受体表达:CLSM结合Western-blot结果显示,OX(10-5M,72 h)上调M1受体表达(P<0.01);荧光定量PCR结果表明,OX(10-5M,20 min)抑制M1受体mRNA表达,OX(40 min和72 h)促进M1受体mRNA表达,MT7部分阻断OX诱导的M1受体mRNA表达(P<0.001);(8)CLSM分析和western-blot结果显示,OX(10-5M,72 h)上调小胶质细胞激活分子CD68和CD11b表达(P<0.001,P<0.01),表明OX促进小胶质细胞活化;MT7部分阻断OX对两者表达的诱导作用(P<0.001);提示M1受体直接调控小胶质细胞活化。(9)OX(10-6 M,10-4 M)与小胶质细胞共同孵育24 h,小胶质细胞TNF-а和IL-10释放减少(P<0.05,P<0.01),OX对IL-1β释放无明显影响。结论:(1)成功改进了原代小胶质细胞培养方法,提高了小胶质细胞分离效率。(2)m AChRs五种亚型受体m RNA均在大鼠皮层小胶质细胞表达,M1受体表达在小胶质细胞胞膜和胞浆。(3)OX激动mAChRs,促进小胶质细胞抗原递呈功能,活化小胶质细胞并调控其炎性介质释放。(4)阻断M1受体,抑制OX诱导的MHCΙ表达和小胶质细胞活化,提示M1受体在mAChRs调控小胶质细胞免疫应答作用中发挥重要作用。