神经干细胞(neural stem cells)是具有自我更新和分化能力的多潜能干细胞，广泛存在于中枢神经系统。海马和室管膜下区是成年中枢神经系统NSCs最为集中的部位，NSCs增殖和分化的机制认识可为促进神经损伤再生提供新的途径。目前以NSCs体外扩增和特化为基础的神经干细胞移植治疗在临床上得到了初步应用，但如何精确调控神经干细胞的增殖和分化，还需要进一步的研究。　　 补体(Complement，C)是天然免疫的重要组成部分，C5a是补体C5活化的主要产物之一，通过其受体(C5aR1/2)途径参与调节免疫炎症、趋化和细胞溶解等多种生物学过程；传统认为中枢神经系统的免疫豁免区，补体在其中作用甚微，但越来越多的的研究发现，中枢神经系统多种细胞能合成大多数补体及其受体蛋白，特别在血脑屏障破坏、中枢神经炎症条件下，补体及其受体的表达上调，提示补体可能在神经系统具有重要的功能。但补体在正常的神经系统以及正常发育的神经系统是否具有功能目前还不清楚。而C5a及其受体在神经系统中的表达也有证明，既往的研究显示在造血干细胞、少突胶质细胞前体细胞中发现有补体受体包括C5aR1的表达，但C5a及其受体在神经干细胞增殖分化过程中的作用目前还没有报道。　　 为了研究C5aR1在神经发育和神经干细胞增殖分化中的作用，本实验首先检测C5aR1在发育过程中小鼠脑内以及体外培养的NSCs内的表达，进而用补体受体特异性拮抗肽干预体外培养的神经干细胞，利用活细胞技术对比观察野生型和C5aR1基因敲除小鼠来源的NSCs体外培养特性，证明C5aR1参与调节神经干细胞增殖的作用，为深入探讨补体系统参与调控NSCs增殖的作用和机制提供新的依据。　　 本实验分为以下三个部分：　　 第一部分：C5aR1在小鼠脑内的发育学表达　　 通过Western blot和免疫组化等技术检测发育不同阶段的小鼠脑内C5aR1的表达变化，主要结果如下：　　 1、在发育不同阶段，C5aR1有不同的表达模式。我们检测了胚胎14天、新生1天、3天、7天以及成年小鼠脑内C5aR1的表达，发现C5aR1在新生3天和7天时期的脑内有较高的表达水平，成年脑内C5aR1表达水平较低。　　 2、比较新生期小鼠脑内不同脑区C5aR1的表达，我们发现，C5aR1主要在海马、室周以及室管膜区域表达，在皮层有较低水平表达。C5aR1在不同脑区的这种表达模式与神经干细胞标志物nestin的表达模式基本相似。　　 以上结果表明：在正常脑发育过程中均有C5aR1的表达，在新生小鼠脑内的表达定位与神经干细胞标志nestin类似，可以推测C5aR1可能参与调节脑发育过程了NSCs的增殖或者分化过程。为了证实这个推测，我们进行第二部分的体外离体研究。　　 第二部分：C5aR1在体外培养神经干细胞中的表达　　 主要通过新生小鼠神经干细胞的培养，免疫组化和Western blot等方法，检测神经干细胞在不同分化阶段的表达变化，得到如下结果：　　 1、成功体外培养神经干细胞：分别从新生的正常小鼠和C5aR1基因敲除小鼠脑内，分离培养NSCs，能连续传代30代并冻存保存原代NSCs。　　 2、撤除生长因子bFGF和EGF后，NSCs能分化为不同类型的神经元和胶质细胞。分化前的NSCs高表达nestin，分化后nestin表达降低。　　 3、C5aR1在nestin阳性神经干细胞内有较高的表达，在NSCs分化后，C5aR1表达水平降低，但分化后细胞的细胞类型与C5aR1的表达无明显相关性。　　 以上结果一方面说明我们掌握了NSCs体外培养方法，另一方面证实了在体外培养的NSCs内有C5aR1的表达，C5aR1的表达对神经于细胞的定向分化无明显影响，我们推测，C5aR1可能参与调节NSCs的增殖过程，据此我们进行下一步的研究。　　 第三部分：C5aR1促进神经干细胞增殖的作用　　 为了研究C5aR1是否对NSCs的增殖具有影响，我们一方面利用C5aR1特异性拮抗肽干预体外培养的NSCs，通过免疫组化和细胞增殖分析等技术，研究C5aR1对神经干细胞分裂增殖的作用；另一方面，利用C5aR1基因敲除小鼠模型与野生型小鼠来源的神经干细胞对比，结合活细胞动态观察技术，分析两种细胞的分裂能力和成球能力。得到如下的结果：　　 1、在不同浓度(0～100ng/ml)的C5aR1特异性拮抗肽作用下，神经干细胞的增殖能力受到抑制，发现10ng/ml浓度的C5aR1拮抗肽的抑制作用最为明显。　　 2、在C5aR1拮抗肽作用下，神经干细胞内nestin的表达受到抑制，BrdU阳性细胞明显减少。　　 3、来源于C5aR1基因敲除小鼠的神经干细胞增殖能力和成球能力明显低于野生型小鼠来源的NSCs。　　 　　 4、活细胞技术观察到C5aR1基因敲除，延迟体外培养的神经干细胞的分裂时间。　　 这些结果发现C5aR1拮抗肽抑制nestin表达，减弱NSCs的增殖能力，C5aR1基因敲除影响了NSCs的分裂和神经球的形成，表明C5aR1对维持NSCs的正常增殖具有积极的作用。该结果与我们第二部分的推测一致。总之，我们的研究结果提示C5aR1可能参与调解脑的发育过程，对神经干细胞增殖具有促进作用，其具体机制还有待我们深入的实验研究。