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【背景】结直肠癌发病率和死亡率分别位于恶性肿瘤的第三位和第二位。放化疗联合分子靶向药物的治疗策略使晚期结直肠癌患者的总生存期增加至3年,但是术后复发、转移和药物耐药的问题难以避免。PD-L1作为免疫治疗靶向的关键分子,阐述PD-L1上调的关键机制并寻找免疫治疗相关生物标志物至关重要。长链非编码RNA作为细胞中重要的调控因子,对肿瘤的十大生物学特征起着复杂精细的调控作用。在结直肠癌中,鲜有长链非编码RNA调节PD-L1表达的报道。【目的】本研究的目的是阐明lncRNA-MIR100HG调控PD-L1表达的作用及机制,为lncRNA在结直肠癌免疫调节过程发挥关键作用提供依据,并寻找免疫治疗相关生物标志物及可能的联合治疗方案。1.构建MIR100HG稳定过表达和敲除的结直肠癌细胞系。2.阐明MIR100HG调控PD-L1表达的功能及机制。3.筛选与自噬相关的MIR100HG互作蛋白。4.探究MIR100HG调控自噬相关互作蛋白的机制。5.拓展探究MIR100HG互作蛋白e EF1A1的功能及机制。6.患者循环检测MIR100HG的方法学探究。【方法】1.利用过表达慢病毒感染和CRISPR/Cas9技术分别构建MIR100HG稳定过表达和敲除的结直肠癌细胞系并利用功能试验验证效率。2.使用空白、自噬激活剂或自噬抑制剂处理MIR100HG过表达或敲除的结直肠癌细胞系并利用功能试验检测自噬流标志物及PD-L1的表达。m RFP-GFP-LC3腺病毒感染MIR100HG过表达及对照细胞系并用共聚焦显微镜验证MIR100HG对自噬流的影响。3.利用ChIRP-MS实验检测MIR100HG的互作蛋白。利用功能试验检测MIR100HG上下调后,ANXA2和HMGA1的m RNA及蛋白水平。放线菌酮及蛋白酶体抑制剂MG132处理后,功能实验检测HMGA1的蛋白质表达情况。通过瞬时转染技术构建ANXA2功能缺失模型,利用功能试验检测自噬流标志物表达并利用核浆分离实验明确MIR100HG上调后AXAN2下游自噬相关分子TFEB的核转位情况。利用功能试验检测MIR100HG上调后促进HMGA1的下游m TOR通路的激活。4.功能实验检测e EF1A1在结直肠癌细胞系及结直肠癌组织的表达情况。利用慢病毒感染及瞬时转染技术在高表达细胞系中构建e EF1A1功能缺失模型,利用质粒转染技术在低表达细胞系中构建e EF1A1功能获得模型并利用功能试验验证效率。利用平板克隆实验、CCK-8实验和流式细胞术评估e EF1A1对结直肠癌细胞系体外增殖能力的影响。利用体内成瘤实验评估e EF1A1敲除对结直肠癌细胞体内增殖能力的影响。加权基因共表达网络分析探究e EF1A1调控结直肠癌进展的潜在机制并利用功能实验验证。组织芯片染色评分后利用乘积极限法评估e EF1A1的表达水平与结直肠癌患者预后的相关性。5.以miR-16-5p和cel-miR-39q为内参,PCR技术检测不同疾病患者循环中阳性对照的表达以选择稳定性和可行性更佳的内参。q PCR技术检测患者血清和血浆样本中miRNA的表达以明确检测样品类型。使用3种来自QIAGEN公司的抽提试剂盒和2种来自Invitrogen公司的TRIzol试剂抽提血浆miRNA,以选择后续检测试剂。【结果】1.成功构建MIR100HG稳定过表达和敲除的结直肠癌细胞系。2.PD-L1蛋白水平与MIR100HG表达水平正相关。MIR100HG过表达后PD-L1的蛋白水平升高;反之MIR100HG敲除后,PD-L1的蛋白水平降低。3.MIR100HG对PD-L1上调作用被自噬激活剂抑制。MIR100HG过表达后,自噬流标志物LC3Ⅱ与p62均上调;反之MIR100HG敲除后,自噬流标志物LC3Ⅱ与p62均下调。m RFP-GFP-LC3腺病毒感染提示未与溶酶体融合的自噬小体增多。功能试验显示MIR100HG对PD-L1的上调作用在自噬激活时抑制。2.Ch IRP-MS结果提示共有97个蛋白与MIR100HG相互作用。其中HMGA1和ANXA2与自噬相关,e EF1A1与增殖相关。核浆分离实验提示,MIR100HG上调后,ANXA2的下游分子TFEB的核转位明显增强。功能试验提示MIR100HG上调后,HMGA1的下游m TOR通路激活增强。q PCR和蛋白免疫印迹技术结果显示,ANXA2表达水平与MIR100HG的表达水平不相关;HMGA1的转录水平与与MIR100HG的表达水平不相关,但是HMGA1的蛋白水平与MIR100HG的表达正相关。蛋白稳定性实验进一步表明,MIR100HG可以增加HMGA1的稳定性并抑制HMGA1的降解。3.e EF1A1高表达是结直肠癌患者预后的独立危险因素。体外增殖实验提示e EF1A1表达下降后,结直肠癌细胞集落生成能力下降;体外增殖能力下降;细胞周期阻滞;凋亡增强。皮下成瘤实验提示e EF1A1表达下降后,体内增殖能力下降。WGCNA及KEGG分析提示e EF1A1与MAPK通路高度相关。4.以cel-miR-39为内参,以血浆为样本类型,使用miRNeasy Serum/Plasma Advanced Kit试剂盒为最优抽提选择;MIR100HG产物miR-125b在健康患者及结直肠癌患者得以成功检测,MIR100HG尚未成功检测。【结论】1.MIR100HG正向调控PD-L1的蛋白水平,且依赖于MIR100HG的自噬抑制功能实现。2.MIR100HG存在与互作蛋白HMGA1一致的激活m TOR通路的作用及与互作蛋白ANXA2一致的促进自噬关键调节因子TFEB核转位的作用。此外MIR100HG可以通过调节蛋白稳定性实现对HMGA1的转录后调控;未发现MIR100HG与ANXA2的表达相关性。3.MIR100HG互作蛋白e EF1A1在结直肠癌中表达升高,且是结直肠癌患者预后的独立危险因素。e EF1A1表达降低后,结直肠癌周期阻滞、凋亡激活,体内及体外的增殖能力下降。WGCNA与KEGG分析提示e EF1A1与MAPK通路显著相关。4.明确结直肠癌患者循环检测MIR100HG的方法学。miR-125b初步检测成功;MIR100HG无成型曲线,需进一步探索。