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研究目的(1)观察不同浓度的人羊膜匀浆上清液(human Amniotic Homogenates Supernatant, hAHS)对体外培养的SD大鼠肺微血管内皮细胞(Pulmonary Microvascular Endothelial Cells, PMVEC)增殖的影响。(2)探讨hAHS对脂多糖(Lipopolysaccharide, LPS)致SD大鼠PMVEC损伤后细胞增殖及PMVEC促炎细胞因子表达的影响。研究方法(1) hAHS的制备及其总蛋白与相关因子含量的测定：取健康剖宫产产妇胎膜,PBS冲洗,于无菌条件下剥离人羊膜,同时鉴定其活力。将活力大于95%的人羊膜剪碎后放入EP管,按体积比1：1加入DMEM/F12匀浆,转移匀浆液并按体积比1：5加入DMEM/F12后离心,离心后取上清液用细菌过滤器过滤,收集滤液,即得到用于细胞培养的hAHS,-80℃冻存备用。参照上述方法,将过程中的DMEM/F12用PBS替代,制得用于细胞因子检测的hAHS,并用考马斯亮蓝法检测其总蛋白含量,ELISA法检测细胞因子EGF、bFGF、 VEGF、IL-4、IL-10、Ang-1、HBD2的含量。(2)观察不同浓度hAHS对体外培养的大鼠PMVEC增殖的影响：将第一代PMVEC培养至第6天后消化并以1×104cell/mL密度接种于96孔板,每孔200μL。孵育24h后弃培养液,按分组更换培养基,并隔天换液。根据培养基配方不同而分为五组(各配方中FBS、 hAHS、DMEM/F12的浓度均指其占培养基总体积的百分数)：0%hAHS组为10%FBS+90% DMEM/F12,10%hAHS组为10%FBS+80%DMEM/F12+10%hAHS,15%hAHS组为10%FBS+75% DMEM/F12+15%hAHS,20%hAHS组为10%FBS+70% DMEM/F12 +20%hAHS,25%hAHS组为10%FBS+65%DMEM/F12+25%hAHS。分别于每组第一次更换培养基后的第0(当天)、1、3、5、7、9、11天用MTT法检测各孔的OD值、绘制生长曲线、计算各组细胞增殖率。(3) hAHS对LPS致PMVEC损伤的保护作用：培养第一代PMVEC至融合度为80%时消化,以4×104cell/mL密度接种于96孔板,每孔200μL。孵育24h后,用含10%FBS的DMEM/F12换液,培养至第2天后,按分组更换培养基。根据培养基中FBS、LPS及hAHS配比不同分为四组(各组培养基中FBS、hAHS、DMEM/F12的浓度均指其占培养基总体积的百分数,LPS浓度均指培养基中LPS的终浓度)：N组10%FBS+90%DMEM/F12, A组10%FBS+75%DMEM/F12+15%hAHS,B组10%FBS+90%DMEM/F12+20μg/mL LPS,C组10%FBS+75%DMEM/F12+15%hAHS+20μg/mL LPS。按照实验分组更换培养基后的第0(当天)、12、24、48、72h用MTT法检测细胞OD值,第6、8、10、12、24h收集细胞培养上清液,采用ELISA法检测各组细胞培养上清液中鼠源性IL-6、IL-8、TNF-α含量。研究结果(1) hAHS中总蛋白含量为(725.125±12.625)mg/L,其中部分细胞因子含量分别为：EGF (504.785±4.665)ng/L、bFGF(4.426±0.138)ng/L、VEGF(0.185±0.006)ng/L,IL-4 (25.650±4.104)ng/L、IL-10(13.733±2.197)ng/L、Ang-1 (15.561±0.496)ng/L、HBD2 (4.763±0.714)ng/L。(2) hAHS促进PMVEC增殖实验中,各组生长曲线趋势为——0%hAHS组,细胞从第0至3天为停滞期,第3天开始缓慢增长,第4天开始进入对数生长期,第7天到达平台期并持续至第10天,继而进入衰亡期；10%hAHS组,前4天与0%hAHS组相似,第4至8天为对数生长期,第8至10天为平台期,继而进入衰亡期；15%hAHS组,前4天与0%hAHS组相似,第4至7天为对数生长期,第7至9天为平台期,继而进入衰亡期；20%hAHS组,与0%hAHS组类似；25%hAHS组,与15%hAHS组类似。各组OD值、增殖率相比——10%hAHS组OD值在第1、3、5天大于0%hAHS组但无统计学差异(P>0.05),在第7、9、11天大于0%hAHS组且有统计学差异(P<0.05)；增殖率在第7天大于0%hAHS且有统计学差异(P<0.05),其他时间点无统计学差异(P>0.05)。15%hAHS组OD值在第1、3天大于0%hAHS组但无统计学差异(P>0.05),在第5、7、9、11天大于0%hAHS组且有统计学差异(P<0.05)；增殖率在第5、7天大于0%hAHS且有统计学差异(P<0.05),其他时间点无统计学差异(P>0.05)。20%hAHS组OD值在各时间点与0%hAHS组相比均无统计学差异(P>0.05),增殖率在第9天小于0%hAHS且有统计学差异(P<0.05),其他时间点无统计学差异(P>0.05)。25%hAHS组OD值在第1、3、5与0%hAHS组相比无统计学差异(P>0.05),在第7、9、11天小于0%hAHS组且有统计学差异(P<0.05)；增殖率在第7、9、11天小于0%hAHS且有统计学差异(P<0.05),其他时间点无统计学差异(P>0.05)。(3) hAHS对LPS致伤PMVEC的保护实验中：A组(hAHS组)在第48、72h的OD值高于对照N组,有统计学差异(P<0.05)；IL-6、IL-8、TNF-α的含量在各时间点与N组(FBS组)相比无统计学差异(P>0.05)。B组(LPS致伤组)在第24、48、72h的OD值低于对照N组,具有统计学差异(P<0.05)；IL-6、IL-8(6h除外)、TNF-a的含量在各时间点均高于对照N组,且具有统计学差异(P<0.05)。C组(LPS+hAHS保护组)在第24、48、72h的OD值高于实验B组,具有统计学差异(P<0.05)；IL-6的含量在10、12h时低于实验B组,IL-8的含量在8、10、12、24h时低于实验B组,TNF-a的含量在各时间点低于实验B组,且具有统计学差异(P<0.05)。研究结论(1) hAHS含有丰富的细胞因子,如EGF、bFGF、VEGF、IL-4、IL-10、HBD2、Ang-1。(2) hAHS在10、15%浓度时对体外培养的SD大鼠PMVEC增殖有促进作用,尤其在15%浓度时促进作用最明显。但在25%时出现抑制PMVEC增殖的现象。(3) hAHS对LPS致SD大鼠PMVEC损伤后细胞增殖具有保护作用,并可降低LPS诱导PMVEC后细胞分泌促炎因子IL-6、IL-8、TNF-α的表达。