论文部分内容阅读
背景和目的微小RNA（microRNA，miRNA）是一类大小约22个核苷酸的保守非编码RNA，能够与下游靶基因mRNA的3’UTR碱基配对并引导基因沉默复合物（RNA-induced silencing complex，RISC）降解mRNA或抑制mRNA的翻译，参与生物合成和肿瘤的发展。肝细胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）的发生、发展及转移是一个多步骤多因素参与的复杂过程。迄今为止，对肝细胞癌组织进行miRNA分子差异表达谱分析的研究也十分有限。目前已有研究表明miR-18a在肝癌组织的表达水平较癌旁正常组织高。我们前期研究结果显示肝癌患者血清中miR-18a水平较健康人高。本课题拟在此基础上进一步探讨miR-18a对肝癌细胞侵袭迁移的影响并阐明其作用机制。方法1、用脂质体介导的转染方法将miR-18a阻遏物（inhibitor），miR-18a阻遏物阴性对照组（inhibitor negative control, inhibitor NC）分别转染肝癌细胞株HepG2及HepG2.2.15。通过transwell侵袭实验检测细胞侵袭能力；采用transwell迁移实验及划痕实验检测细胞迁移能力。2、生物信息学方法预测Dicer1为miR-18a的靶基因。用脂质体介导的转染方法分别将靶向沉默Dicer的小干扰RNA（small interfering RNA, siRNA）与miR-18ainhibitor共转染肝癌细胞株HepG2及HepG2.2.15，并设置Dicer siRNA的阴性对照（negative control siRNA，siRNA NC）与miR-18a inhibitor共转染为对照组，以及miR-18a inhibitor组、inhibitor NC对照组，transwell侵袭实验检测细胞侵袭能力，transwell迁移实验及划痕实验检测细胞迁移能力，westem blot检测Dicer l蛋白表达，观察miR-18a对肝癌细胞侵袭、迁移的影响是否通过抑制Dicer1表达发挥。结果1、Transwell侵袭及迁移实验结果显示：与对照组比较，转染miR-18a inhibitor72h后，HepG2及HepG2.2.15细胞侵袭和迁移能力均显著降低，平均每高倍视野（×200）侵出小室的细胞数与NC组相比均显著减少，HepG2细胞miR-18a inhibitor组分别为NC组的0.410倍、0.446倍（P<0.01）；HepG2.2.15细胞miR-18a inhibitor组分别为NC组的0.565倍、0.602倍（P<0.01）。划痕实验显示HepG2及HepG2.2.15细胞划痕后24h、48h、72h，miR-18ainhibitor组划痕愈合速度明显慢于NC组（均P<0.05）。2、Western blot检测及transwell侵袭及迁移实验结果显示：与转染inhibitor NC组相比，转染miR-18a inhibitor组48h后细胞中Dicer1蛋白表达水平显著升高（P<0.01），transwell显示细胞侵袭和迁移能力均显著减弱，平均每高倍视野（×200）侵出小室的细胞数与NC组相比均显著减少，HepG2细胞miR-18a inhibitor组分别为NC组的0.462倍、0.460倍（P<0.01）；HepG2.2.15细胞miR-18a inhibitor组分别为NC组的0.574倍、0.579倍（P<0.01）。与共转染siRNA NC+miR-18ainhibitor组相比，共转染Dicer siRNA+miR-18a inhibitor48h后细胞中Dicer1蛋白表达水平显著降低（P<0.01），同时transwell显示细胞侵袭和迁移能力均显著增强，平均每高倍视野（×200）侵出小室的细胞数与siRNA-NC+miR-18a inhibitor组相比均显著增多，HepG2细胞Dicer siRNA+miR-18a inhibitor组分别为siRNA-NC+miR-18a inhibitor组的2.079倍、2.193倍（P<0.01）；HepG2.2.15细胞Dicer siRNA+miR-18a inhibitor组分别为siRNA-NC+miR-18a inhibitor组的1.619倍、1.777倍（P<0.01）。划痕实验显示HepG2及HepG2.2.15细胞划痕后24h、48h、72h，共转染Dicer siRNA+miR-18a inhibitor组划痕愈合速度明显快于siRNA NC+miR-18a inhibitor组（均P<0.05）。证明了miR-18a通过负向调控Dicerl的表达影响肝癌细胞的侵袭、迁移能力。结论1、MiR-18a促进肝癌细胞的侵袭、迁移。2、MiR-18a促进肝癌细胞的侵袭、迁移的作用通过靶向抑制Dicer1表达而发挥。