研究背景经皮冠状动脉介入治疗(percutaneous coronary intervention,PCI)是治疗冠状动脉分叉病变最有效的技术之一,但它术式复杂、术后并发症和支架内再狭窄风险高。PCI治疗冠状动脉分叉病变难度较大且风险很高,因为向主支释放支架会挤压侧支,导致侧支口狭窄,甚至闭塞,这已成为分叉病变PCI患者发生主要不良心血管事件的决定性原因之一。PCI用于治疗冠状动脉分叉病变的主要目的是确保冠状动脉主支和侧支的通畅,减少侧支术后再狭窄的发生。临床上,对吻球囊技术是保护冠状动脉侧支的优选技术。然而,对于丰富和较小的侧支,通过使用普通球囊(plain balloon,PB)难以实现狭窄段的扩张,手术成功率低。由于上述困境,切割球囊(cutting balloon,CB)应运而生。由于金属刀片均匀地分布在CB表面,故可以切割、分离和移位斑块,并防止移位的斑块堵塞血管侧支。与PB相比,CB可使冠状动脉狭窄段形状规整,最大限度地减少支架扩张过程对内膜和中膜的损伤,从而保护侧支,减少围手术期并发症的发生率。因此,CB特别适用于丰富和小侧支的治疗。此外,糖尿病(diabetes mellitus,DM)是冠心病常见的合并症,对于冠心病患者并发DM的患者,冠心病通常表现为多支血管、多部位弥漫性狭窄,血管顺应性差,此类患者行PCI的风险较高。迄今鲜有关注此类患者中应用CB的研究报道。因此,本研究DM患者行PCI中比较了 CB和PB对分叉病变的疗效和安全性。研究对象本研究选择2015年5月至2016年5月山东大学齐鲁医院心内科收住并经冠状动脉造影诊断的冠状动脉分叉病变合并糖尿病患者。应用Duke分型方法选取分型中D期或F期的88名患者(共96个冠状动脉分叉病变)随机分为CB组(n=44)和PB组(n=44)。如果患者冠状动脉造影显示冠状动脉分叉病变,侧支血管直径2～～3 mm,且狭窄程度超过75%,则需要在主支支架置入时对侧支进行保护,避免累及侧支口或侧支闭塞。入选标准:年龄18～85岁,冠状动脉分叉病变合并糖尿病。排除标准:目标血管病变为再狭窄病灶或严重钙化;成角和扭曲的桥血管病变;ST段抬高型急性心肌梗死;既往PCI手术;抗血小板治疗禁忌证;DM合并严重并发症包括糖尿病肾病、眼部并发症或糖尿病足。研究方法所有患者均通过经股动脉或经桡动脉入路进行冠状动脉造影,获得患者冠状动脉造影影像。在PCI术前和术后分别测量冠状动脉主支和侧支血管直径,记录最小血管直径(minimal lumen diameter,,MLD)。在PCI手术前,给予抗血小板聚集类药物、他汀类降脂药,并进行降糖及降压治疗。在PCI手术期间,给予100 U/kg肝素静脉输注,若PCI手术超过2小时可每小时追加1000 U肝素。对冠状动脉分叉病变进行支架置入,必要时同时对主支及侧支病变进行支架置入术。两组分别基于病变长度和参考直径的比值(1.0～1.1:1.0)选择合适型号的球囊。CB组患者单纯使用CB进行冠状动脉分叉病变的预扩张,而PB组患者则仅用PB接受分叉病变的预扩张。在用球囊完全预扩张分叉病变后,将支架置入主支血管中。根据侧支受挤压程度决定对吻球囊扩张技术或双支架置入术。主支支架置入后,当侧支显示良好的血流动力学即TIMI(thrombolysis in myocardial infarction)血流达到3级并且血管狭窄小于50%时,密切观察患者但不需要后续治疗。在侧支出现明显血流动力学异常的情况下,即TIMI血流≤2级且狭窄程度大于50%,根据侧支血管内膜撕裂和闭塞情况进行对吻球囊扩张技术或双支架置入术。确保CB保持负压状态,不含任何气体或液体,并且叶片均匀地分布在球囊表面。为了确保良好的支撑,CB通过适当的导管或导丝输送。CB预处理过程中的压力应逐渐增加,然后释放和撤出。观察术后侧支闭塞及挤压程度,以及围手术期并发症情况。研究结果1.患者的基线临床资料结果比较对两组患者的基线临床资料进行比较,其中包括患者年龄、性别、高脂血症及高血压的合并症、左心室射血分数、糖尿病分期、空腹血糖、空腹胰岛素及糖化血红蛋白,均无显著差异(P>0.05)。两组患者冠状动脉病变的血管数目、分叉部位、病变分类无显著差异(P>0.05)。2.患者PCI术前术后主支血管与侧支血管MLD的比较PB组和CB组患者PCI术后主支血管MLD均大于PCI前,两组间术前术后MLD差值无统计学意义(P>0.05)。PB组和CB组患者PCI术后侧支血管MLD均大于PCI前,并且CB组术前术后MLD差值显著大于PB组(P<0.05)。3.PB组和CB组PCI术后侧支挤压和闭塞的发生率比较即刻血管造影显示,与PB组相比,CB组术后侧支挤压和闭塞的发生率明显降低,未受影响的侧支的比例明显升高(P<0.05)。4.PB组和CB组围手术期并发症比较两组患者围手术期均未发生死亡、心律失常和心力衰竭,但CB组发生围手术期心肌梗死的概率显著低于PB组(P<0.05)。结论PCI术后两组患者的主支血管MLD均大于PCI前,但是两组间术前术后MLD差值无显著差异。虽然PCI术后两组患者的侧支血管MLD均大于PCI前,但CB组术前术后MLD差值显著大于PB组;术后即刻血管造影显示,与PB组相比,CB组侧支挤压和闭塞的发生率显著降低,未受累侧支的比例显著较高。在PCI术后48小时内,两组患者围手术期均未出现死亡、心律失常及心力衰竭,但CB组发生围手术期心肌梗死的概率显著低于PB组。由于冠状动脉分叉病变合并糖尿病时多为多支、弥漫性病变,而且侧支斑块负荷往往较重,对于此类患者特别是Duke分型D期或F期(即侧支口合并斑块)的患者,PCI时应用CB技术可明显减少侧支挤压和闭塞,降低围手术期心肌梗死的发生率。研究背景冠心病,也称为冠状动脉粥样硬化性心脏病(CHD),是由负责向心肌供应富氧血的冠状动脉中斑块的形成引起的[1]。冠状动脉阻塞导致心脏营养不良、供血液和供氧气不足。因此,CHD又被称为缺血性心脏病[2]。冠心病是一组心血管疾病,包括稳定型心绞痛、不稳定型心绞痛、心肌梗死,甚至心源性猝死,是全球人口死亡的主要原因,在发展中国家例如中国亦不例外[2-3],超过40%的死亡与CHD有关[4]。更糟糕的是,由于生活方式的改变,例如随着西式饮食的普及,这种疾病的发病率预计会持续增加[5]。虽然在CHD的治疗方面已经取得了进展,但临床获益常不尽人意[6]。因此,深入研究不同类型的冠心病的发病机制对降低CHD患者的发病率和死亡率无疑具有重要的临床意义。转化生长因子-β1(TGF-β1)可通过调节细胞增殖、生长、分化和凋亡,在各种正常的生理和病理过程中发挥着关键作用[7]。TGF-β1在血管形态发生和功能障碍中的参与作用已经被广泛研究,并且TGF-β信号通路已经被证明对心血管疾病的发生发展至关重要[8]。在包括CHD在内的多种人类疾病的发展过程中,均可观察到TGF-β1的表达水平增加[9]。鞘氨醇激酶,包括鞘氨醇激酶1(SPHK1)和基质金属蛋白酶的组织抑制剂-1(TIMP-1),同样在血管的发育中起着关键作用[9,]10]。SPHK1可与不同的信号分子如血管内皮生长因子相互作用,以调节血管生成[10]。TIMP-1的分泌促进了新血管的形成。但是,这些蛋白质的功能及其在CHD发生发展中潜在的分子机制仍然不清楚[11]。因此,我们的研究旨在探讨这些蛋白质在CHD发生发展中的作用,并探讨其可能的分子机制。研究材料入选标准:本研究纳入2016年1月至2017年1月入住收住于山东大学齐鲁医院心内科的60名例冠心病患者,这些患者均符合美国心脏病学院(ACC)/美国心脏协会(AHA)冠状动脉造影确诊的标准。入选患者包括33名男性和27名女性,年龄32～73岁,平均年龄为51±6.9岁。同时,选择54名与CHD组患者年龄和性别相匹配的健康人作为对照组。排除标准:合并其他心血管疾病、恶性肿瘤或严重疾病;入院前6周内或入院后6周内存在严重感染;活动性慢性炎症性疾病。研究方法1.血清标本留取及酶联免疫吸附实验入院当天抽取每位受试者的全血。血样在室温下保存2小时,以2000 rpm离心30分钟以分离血清。然后,使用TGF-[β1 ELISA试剂盒(R&D Systems,Inc.Minneapolis,MN)检测血清TGF-β1水平,应用重组人TGF-β1作为校准品,进行酸活化以释放生物活性TGF-β1。血清样品在DPBS缓冲液中以1:75的比例稀释,并直接加入ELISA平板中,以测量活性TGF-β1的浓度。每次测量分别进行3次并计算平均值。2.细胞培养人原发性冠状动脉内皮细胞(HCAEC)是从ATCC(ATCC(?)PCS-100-020TM)中获得的。根据ATCC方案进行细胞培养,无血清培养基用于药物治疗。在对数生长期收集细胞用于后续实验。3.转染TGF-β1 siRNA(catalog#AM 16708)、TIMP-1 siRNA(catalog#AM 16708)和 Silencer(?)阴性对照#1 siRNA(catalog#AM461 1)由 Thermo Fisher science提供。含有全长TGF-βl基因的EcoRI-EcoRI片段将cDNA、SPHK1基因cDNA或TIMP-1 cDNA插入pIRSE2-EGFP(Clontech,Palo Alto,CA,USA)载体分别建立TGF-β1、SPHKI和TIMP-1表达载体。空的pIRSE2-EGFP载体被用作阴性对照。转染前,HCAEC细胞过夜以达到70～80%汇合。Lipofectamine 2000转染试剂(11668-019,Invitrogen,Carlsbad,USA)被用于转染50 nM siRNA或 10 nM载体转化为5×106细胞。4.MTT甲基叔丁基醚试验转染后,细胞培养基中含有10tetraethylammonium(TEA)在密度5×104细胞/ml,以诱导细胞凋亡。然后,将100μl细胞悬浮液(5×103细胞)添加到96井板中的每一个井中。细胞培养在孵化器(37℃,5%C02)内6小时后加入10μl的MTT。之后,细胞继续培养4小时,并且应用FisherbrandTM AccuSkannM GO UV/Vis Microplate Spectrophotometer(Fisher Scientific)光学密度测量仪进行测量。细胞凋亡率标准化为凋亡率最高的细胞。每个样品分别进行3次检测。5.Western blottingRIPA裂解液(Fisher Scientific)用于提取体外培养细胞中的总蛋白,并利用BCA方法对蛋白质样品进行量化。对20 u g蛋白进行10%SDS-PAGE gel凝胶电泳,然后转移到PVDF膜,应用5%脱脂牛奶进行封闭。之后,膜应用TBST洗涤3次,每次10分钟。孵育的主要一抗包括TGF-β1(1:2000,ab92486,Abcam),SPHK1(1:2000,ab46719,Abcam),TIMP-1(1:2000,ab61224,Abcam)和GAPDH(1:1000,ab9845,Abcam)在4℃冰箱中隔夜。第二天,用TBST洗膜3次,每次10分钟,其次在室温下1小时孵育二抗anti-rabbit IgG-HRP secondary antibody(1:1000,MBS435036,MyBioSource)。用TBST清洗15分钟后,再应用ECL发光液(Sigma-Aldrich,USA)。利用图像 J 软件对TGF-β1、SPHK1 和TIMP-1的相对表达水平进行归一化处理,内参蛋白为GAPDH,每个样品重复检测3次。结果1.冠心病患者与健康对照组血清TGF-β1水平的比较及其诊断价值CHD患者和健康对照组间血清总TGF-β1水平无显著差异。然而,CHD患者血清中活性TGF-β1水平明显高于对照组(P<0.05)。应用ROC曲线分析以评估血清总TGF-β1和活性TGF-β1水平对冠心病的诊断价值。诊断CHD时血清总TGF-β1水平的曲线下面积(AUC)为0.5109(P=0.8429)。血清活性TGF-β1水平在冠心病诊断中的AUC为0.9627(P<<0.0001)。这些数据表明血清活性TGF-β1水平可作为诊断冠心病潜在的生物标志物。2.TGF-β1 siRNA沉默和过表达对HCAEC细胞凋亡的影响应用qPCR方法获取TGF-β 1 siRNA沉默和过表达细胞系。采用MTT法研究TGF-β 1 siRNA沉默和过表达对HCAEC细胞凋亡的影响。与对照HCAEC相比,TGF-β1 siRNA显著抑制细胞凋亡(P<0.01)。相反,TGF-β1过表达显著促进细胞凋亡(P<0.01)。这些数据表明,TGF-β1信号传导可促进HCAEC细胞凋亡。3.HCAEC中TGF-β 1是SPHK1和TIMP-1的上游调节因子TGF-β1过表达可显著上调HCAEC中SPHK1和TIMP-1的表达(P<0.05)。而SPHKI和TIMP-1过表达对TGF-β1水平无明显影响(P>0.05)。表明TGF-β1在HCAEC中是SPHK1和TIMP-1的上游调节因子。4.HCAEC中SPHK1是TIMP-1的上游调节因子SPHK1过表达可显著上调HCAEC中TIMP-1的表达(P<0.05)。但TIMP-1过表达对SPHK1表达没有显著影响(P>0.05)。表明SPHK1在HCAEC中是TIMP-1的上游调节因子。5.SPHK1抑制剂和TIMP-1沉默可降低TGF--1过表达的促细胞凋亡作用SPHK 1抑制剂5C处理1小时或TIMP-1沉默可显著减弱TGF-β1过表达的促细胞凋亡作用(P<0.05)。此外,细胞凋亡的模式与TIMP-1的表达模式类似。结论CHD患者血清活性TGF-β1水平高于健康对照组。血清中活性TGF-β1水平增高可作为诊断CHD的潜在的新的生物标记物。TGF-β1过表达显著促进了HCAEC的凋亡,TGF-β1 siRNA沉默显著抑制了 HCAEC的凋亡。TGF-β1过表达显著增加了 SPHK1和TIMP-1的表达水平。SPHK1过表达上调TIMP-1的表达。SPHK1抑制剂和TIMP-1沉默可降低TGF-β1过表达的促细胞凋亡作用。据此可以推论,TGF-β]通过上调SPHK1表达并进一步上调TIMP-1,从而促进了冠状动脉内皮细胞凋亡,进而参与了冠心病的发生和发展。