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急性肝衰竭（acute liver failure, ALF）是各种肝脏疾病主要的致死原因之一，以进展迅速的肝性脑病以及严重的肝功能损害为特点。肝脏移植被认为是对急性肝衰竭最佳最有效的治疗方法，然而供肝的缺乏是严重阻碍着肝移植的广泛开展和应用的瓶颈。细胞移植因其优点也成为替代肝移植手术治疗急、慢性终末期肝病最有前景的方法[1,2]。胎肝干/祖细胞（FLSPCs）为干细胞治疗各种肝病的最理想细胞之一。本实验利用课题组之前报道的三部分离法在F344胎鼠中有效富集、纯化、体外扩增胎肝干细胞，并用pAcGFP1-N1转染干细胞，使其能表达GFP（green fluorescenceprotein, GFP）作为示踪。以同种F344大鼠作为实验对象，利用四氯化碳腹腔注射制造急性药物性肝衰竭大鼠模型、外科手术方法切除85%大鼠肝脏，制作急性肝损伤肝衰竭大鼠模型。12小时后将转染后的胎肝干细胞经尾静脉途径分别注射入上述模型体内，分选不同时间段观察肝脏修复情况。于干细胞移植后12小时后，治疗组与对照组肝功能即出现统计学意义，72小时凝血检查、病死率及肝脏病理切片检查均显示治疗组优于对照组。在验证胎肝干细胞治疗急性肝衰竭的可能性和有效性的基础上，构建大鼠肝脏断面门静脉分支的残端静脉置管模型，利用胎肝干细胞经过不同的移植途径验证新模型的优劣。肝功检查结果表明经新模型置管途径移植细胞治疗效果等同于经门静脉穿刺移植治疗效果。以此得出结论：1．三步分离法提取的胎肝干细胞具有一定改善急性肝衰竭大鼠的肝功能、凝血及肝脏病理指标的作用。2．经门静脉分支残端置管途径移植FLSPCs效果等同于经门静脉穿刺途径。目的1．研究移植胎肝脏原始/干细胞对治疗药物性急性肝功能衰竭及急性损伤性肝衰竭大鼠的可能性与有效性。2．构建大鼠肝脏断面门静脉分支的残端静脉置管模型，并在实验一的基础上进行不同途径的胎肝干细胞细胞移植实验，以此来对比分析新模型的优劣。方法1．胎肝干细胞的富集、纯化和转染示踪于胎龄14d的F344孕鼠中提取胎肝，经酶消化后，利用三步分离法进行FLSPCs的提取、纯化、体外扩增。并用pAcGFP1-N1转染干细胞，使其能表达GFP作为示踪。2．急性肝衰竭动物模型的构建、干细胞的植入以及测定移植修复的指标将80只F344大鼠分为四组。A、B组按3ml/kg予腹腔一次性注射四氯化碳(CCl4)溶液，C、D两组行肝脏85%切除，12小时后予以B、D两治疗组尾静脉注射1×106个胎肝干细胞，A、C两对照组注射等剂量培养液，在不同时间段提取四组大鼠血清，测定肝功能ALT、AST、TBIL、ALB，及凝血指标PT，统计死亡率、腹水生成量；取肝脏组织切片观察其修复情况。3．构建大鼠肝断面门静脉分支残端的静脉置管模型，并进行胎肝干细胞的细胞移植实验，进行肝脏修复指标测试以对比分析新模型的优劣。60只F344大鼠分为三组。E、F组行行85%肝切除术；G组行85%肝切除术+肝断面门静脉分支残端置管术。术中F组经门静脉注入4×105个表达GFP（greenfluorescence protein, GFP）的胎肝干细胞（fetal liver stem/progenitor cells, FLSPCs）。G组经留置导管注射入同等量的FLSPCs，E组注射同等剂量的培养液。72小时取血清，测定肝功能ALT、AST，统计死亡率；取肝脏组织切片观察其修复情况。统计学采用方差分析和LSD-t检验。结果1．三步分离法能有效从14d胎龄的F344孕鼠胚胎肝脏中富集FLSCs。细胞增殖速度快、贴壁快，细胞长满后呈铺路石样外观。细胞体积小、大小、形态均匀一致，多呈三角形或多角形，核浆比例较大。2．在移植胎肝干细胞后12小时后，两模型组内的肝功能指标检测（ALT、AST、TBIL、ALB)即开始出现统计学差异（P<0.05）。A组ALT、AST、TBIL、ALB均值分别为(5404.17±376.94)U/L、(6823±348.99)U/L、(98.43±5.21)umol/L、(24.12±1.21)g/；B组为：(4807±244.62)U/L、(5290.67±289.68)U/L、(83.67±3.501)umol/L、(26.33±1.21)g/L； C组分别为：(1946.3±106.87)U/L、(3834.5±230.05)U//L、(102.50±8.24)umol/L、(17.83±1.72)g/L； D组分别为：(1400.5±124.07)U/L、(2985±134.07)U/L、(83±7.61)umol/L、(21.33±1.86)g/L。在移植后36小时、60小时检测肝功，随时间推移B、D组肝功指标恢复改善明显优于相应对照组。60小时测PT值及腹水均分别优于两对照组（P<0.01）；干细胞移植后60小时后取出肝脏行冰冻切片检查： A组损伤重、结构破坏明显，大面积肝细胞坏死，肝小叶破坏；B组较对照组明显减轻；C组肝细胞增生不明显，伴有炎细胞浸润；D组见肝细胞增生广泛，肝小叶结构恢复明显。3．表达GFP示踪的胎肝干细胞经模型留置管道移植及经门静脉穿刺移植后72小时检测肝功能数据显示F组ALT、 AST分别为(802.83±79.22)U/L、(1463.50±56.22)U/L; G组ALT、AST分别为(827.83±63.08)U/L、(1472.83±52.41)U/L；E组ALT （1275.67±329.59)U/L、(2806.83±157.0)U/L。F组G组两者间无明显统计学差异，但均优于对照组。两者病理学检查均提示肝脏体积较对照组有所增大，肝叶代偿，镜下见肝细胞增生明显，肝索结构较完整，肝小叶结构较E组有较明显恢复。E组病理学显示剩余肝叶代偿性肿大。镜下可见肝窦及中央静脉扩张，伴有炎细胞浸润，肝细胞增生不明显。提示经门静脉分支残端置管途径移植FLSPCs治疗急性肝损伤性肝衰竭效果等同于经门静脉穿刺途径。结论1．三步分离法提取的胎肝干细胞具有一定改善急性肝衰竭大鼠的肝功能、凝血及肝脏病理指标的作用。2．经门静脉分支残端置管途径移植FLSPCs效果等同于经门静脉穿刺途径，且该模型具有可反复、可选时、减少创伤等优点。