研究表明，启动分娩的许多信号可通过调节离子通道进而改变子宫平滑肌的舒缩状态使得子宫兴奋。大电导钙离子激活的钾通道(BKCa)，作为在子宫肌上表达量最高的钾离子通道在调控子宫肌的收缩性方面起重要作用。研究表明，促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)及其相关肽可通过CRH-R1和CRH-R2两种不同亚型的受体介导的作用，调节子宫肌的舒缩状态，进而参与妊娠和分娩的诸多环节。然而其作用的具体靶点目前还不是很清楚。因此在本课题的第一部分，我们以原代培养的临产和未临产子宫平滑肌细胞为模型，使用CRHR1和CRHR2的特异受体拮抗剂antalarmin和astressin2B、广谱受体拮抗剂astressin，研究了子宫肌不同状态下内源性CRH通过CRHR1和CRHR2介导的对BKCa的调节作用；并且通过给予外源性的CRH，进一步叨确了CRH通过不同受体介导的调节BKCa的综合作用。　　 妊娠末期分娩的启动机制极其复杂，体内各类激素水平、收缩相关蛋白表达量及其他因素的改变共同作用进而启动分娩的进程，其中气体信号分子的作用逐渐为人们所认识。已有研究表明，NO和CO能通过GC-cGMP途径舒张子宫平滑肌，参与其静息状态的维持。H2S作为第三类气体信号分子，可通过激活ATP敏感的钾离子通道(KATP)舒张血管平滑肌，但目前对其在子宫肌上的表达和功能了解还很有限。因此在本课题的第二部分中，我们对内源性血管舒张因子H2S及其下游靶分子KATP通道是否参与妊娠及分娩展开研究，着重研究了不同状态子宫肌中H2S合成相关酶CBS和CSE的表达；并测定其合成H2S的速率，进一步研究H2S对不同状态子宫平滑肌的调节作用以及KATP构成亚基在不同状态子宫平滑肌中mRNA及蛋白水平的表达。　　 实验结果如下：　　 一、CRH通过不同受体对妊娠子宫平滑肌细胞上BKCa的调节作用　　 1.免疫组化发现，子宫平滑肌组织中存在内源性CRH的表达。　　 2.放射性免疫方法测定原代培养的临产状态子宫平滑肌细胞内源性CRH的分泌量要高于未临产状态子宫平滑肌细胞。　　 3.分别使用CRHR1的特异性拮抗剂antalarmin和CRHR2的特异性拮抗剂astressin2B处理细胞，发现在未临产子宫平滑肌细胞上，antalarmin下调BKCa核心α亚基和调节β亚基的mRNA和蛋白表达，astressin2B上调两种亚基的mRNA和蛋白表达；在临产子宫平滑肌细胞上，antalarmin上调α亚基和β亚基的mRNA和蛋白的表达，astressin2B下调α亚基的mRNA和蛋白的表达，但对β亚基的表达没有明显调节作用。并且两种特异性拮抗剂的对α亚基和β亚基调节作用在未临产及临产子宫肌细胞上存在剂量依赖效应及时间依赖效应。　　 4.使用外源性CRH处理子宫平滑肌细胞，发现在未临产子宫平滑肌细胞上α亚基和β亚基的mRNA和蛋白表达均呈剂量依赖性和时间依赖性增加；在临产子宫肌细胞上，α亚基和β亚基的mRNA和蛋白表达减少，亦存在剂量及时间依赖效应。　　 5.在未临产子宫肌细胞上，外源性CRH对α亚基和β亚基表达的上调作用，可以被CRHR1的特异性拮抗剂antalarmin完全阻断，不能被CRHR2的特异性拮抗剂astressin2B阻断，可被受体广谱拮抗剂astressin部分阻断。这表明外源性CRH在未临产子宫肌上通过不同受体介导的作用不尽相同，但主要通过CRHR1增加BKCa的α亚基和β亚基的表达。在临产子宫肌细胞上，外源性CRH对α亚基表达的下调作用，可被antalarmin完全阻断，不能被astressin2B阻断，可被astressin部分阻断。而β亚基表达受外源性CRH下调的趋势，只能被antalarmin和astressin部分阻断。这表明在临产子宫平滑肌上，外源性CRH是通过CRHR1介导的作用，下调了BKCa的表达。　　 6.利用RNA干扰技术使原代培养的未临产子宫肌细胞CRHR1及CRHR2分别表达减少。在此模型上观察到，CRH可下调si-CRHR1转染的未临产子宫肌细胞上BKCa的表达，该作用可被CRHR2特异性阻断剂逆转；CRH对si-CRHR2转染的子宫肌细胞上BKCa的表达具反方向调节作用。这一结果证实未临产子宫平滑肌上CRH通过CRHR1介导对BKCa的表达的上调作用，CRHR2介导的作用与之相反。　　 二、不同状态妊娠子宫平滑肌中H2S合成相关酶和KATP通道的表达　　 1.免疫组化证实在子宫平滑肌组织上存在H2S两种合成相关酶CBS和CSE的表达。　　 2.临产状态的子宫平滑肌下段中CBS的mRNA和蛋白表达量均比未临产状况明显下降，而CSE只存在mRNA水平上表达量下调，蛋白水平表达没有明显变化。表明子宫平滑肌CBS表达量的改变可能导致内源性H2S的生成量变化，而未临产子宫肌下段中H2S合成酶较高的表达量与平滑肌静息状态的维持密切相关。　　 3.极谱法实时测定不同状态妊娠子宫肌下段中H2S合成酶生成H2S的速率，结果表明未临产子宫肌中生成H2S速率要远远高于临产子宫肌。提示由于H2S具有舒张平滑肌的作用，其高生成率亦可能是妊娠期间维持子宫肌静息状态的影响因素之一。　　 4.免疫组织化学的方法表明，构成KATP通道的四种亚基(Kir6.1、Kir6.2、SUR1、SUR2B)在子宫平滑肌上均有表达。　　 5.荧光实时定量PCR结果显示，在临产子宫肌上两种通道核心组成单位Kir6.1和Kir6.2的表达量比未临产子宫肌上的表达量下降，而两种调节组成单位SUR1和SUR2B表达并无明显变化。在蛋白表达水平上，临产状态下的Kir6.1和Kir6.2的表达量明显减少，而SUR1的表达量上升，同时SUR2B的表达没有发生明显变化。这说叨KATP通道在不同状态的子宫肌上主要是通过改变其核心组成单位的表达来调节子宫平滑肌的静息状态。　　 结论：　　 本研究表明，CRH通过其不同亚型受体介导的作用对子宫平滑肌中BKCa的表达起到相反的调节作用，但以CRHR1的作用为主，BKCa表达量的改变可能是CRH对子宫肌组织双向调节作用的机制之一。此外，气体信号分子H2S及其合成相关酶CBS、CSE表达量在临产子宫肌发生显著变化，与H2S对平滑肌作用密切相关的下游靶分子KATP通道的表达量在临床和未临产子宫肌也有显著差别，提示H2S和KATP可能亦参与了妊娠的维持和分娩启动的复杂过程。